COPD大鼠膈肌肌肉生长抑制素mRNA表达和凋亡的相关性研究

于海明，周 煦，裴兴华，卢 武，肖 彦，吴艳红

（湖南省人民医院重症医学科，长沙 410005）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以进行性气流受限和肺功能丧失为特点的慢性炎症反应性疾病［1］，是全球死因第三名的疾病。COPD常累及全身骨骼肌系统，尤其是呼吸肌，呼吸肌消耗及功能障碍引起的呼吸衰竭是COPD患者晚期死亡的最重要原因［2］。膈肌是最主要的呼吸肌，约占全部呼吸功能的60-80%［3］。肌肉生长抑制素（myostatin），又称为生长分化因子8（GDF-8），是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，主要表达于骨骼肌，抑制肌肉的生长发育，参与骨骼肌的消耗和功能障碍［4］，在许多消耗性疾病或年龄增长所引起的肌肉萎缩中均发现myostatin增高［5］。COPD时同时存在膈肌萎缩和凋亡，但膈肌myostatin表达是否与膈肌凋亡萎缩相关尚不明确。本研究将通过单纯熏香烟法复制大鼠COPD模型，检测膈肌组织myostatin mRNA表达和凋亡萎缩情况，探讨二者之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 实验动物8周龄雄性SD大鼠，体重200～250g，购于湖南斯莱克竞答实验动物有限公司，动物许可证编号：SCXK（湘）2015-0013。

1.2 主要实验试剂芙蓉牌香烟（焦油12mg/支）购自湖南中烟工业有限责任公司，瑞氏-姬姆萨染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒和PCR试剂购自Fermentas公司，原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，引物序列由上海生工公司合成。

1.3 动物分组和模型SD大鼠通过随机数字法分为正常对照组（n=8）和COPD组（n=8）。COPD大鼠模型建立：采用单纯熏香烟法制备COPD模型［6］，烟雾暴露箱（72.8cm×52.4cm×45.8cm）：由整理箱改装而成，利用有机玻璃将箱体分隔2层，上2/3为烟雾暴露区，下1/3为燃烟区，箱盖、箱底及隔面均有数个1cm×1cm大小的通气孔。将大鼠放置入烟雾暴露箱中被动吸烟，同时燃烧6支香烟（每间隔4周加1支香烟），20分钟后香烟燃烧完全，烟雾消失后待大鼠休息5分钟，再重复烟雾暴露一次。4小时后重复上述烟雾暴露。每天共烟雾暴露4次，连续20周。正常组大鼠每天放置入烟雾暴露箱，但不进行烟雾暴露。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠一般情况观察大鼠外观、行为、活动及对刺激的反应。

1.4.2 支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞分类计数按照文献报道方法收集BALF［7］，暴露气管及双肺，结扎右主支气管，从气管下1/3做倒T字切口后，用针头插入左肺，向左肺缓慢灌注无菌生理盐水3mL，再缓慢抽出，重复3次，所得溶液记为BALF。收集的BALF混匀后通过血细胞计数器统计细胞总数；再通过瑞氏-姬姆萨染色作细胞分类计数。

1.4.3 大鼠体重、膈肌重量记录造模前后大鼠体重和造模后大鼠膈肌重量。

1.4.4 膈肌凋亡指数通过TUNEL法检测膈肌细胞凋亡，具体按说明书进行操作。凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4.5 肌肉生长抑制素mRNA表达通过Trizol法提取膈肌组织总RNA，通过逆转录试产生cDNA，RTPCR检测myostatin mRNA表达，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，计量资料的比较采用t检验，相关性分析采用Pearson直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性阻塞性肺疾病大鼠一般情况造模前大鼠饮食正常、行动敏捷、皮肤清洁有光泽；COPD造模后大鼠精神萎靡、饮食进水减少、活动迟缓、毛发黄涩，呼吸频率加快，部分大鼠可见口鼻内分泌物，或出现烦躁不安表现。

2.2 慢性阻塞性肺疾病大鼠BALF细胞分类计数造模后，COPD组BALF中白细胞总数、中性粒细胞绝对值及百分比、巨噬细胞绝对值高于正常对照组（P<0.05），而巨噬细胞所占百分比降低（P<0.05），结果见表2。

表2 两组大鼠BALF中细胞计数和分类比较

2.3 慢性阻塞性肺疾病大鼠体重和膈肌重量造模后，COPD组大鼠体重（446.82±30.69）g低于正常对照组（584.87±21.13）g，差异有统计学意义（P<0.05），其膈肌重量（1.31±0.16）g也低于正常对照组（1.726±0.073）g，差异有统计学意义（P<0.05），结果见表3。

表3 两组大鼠体重和膈肌重量比较

2.4 慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌凋亡指数正常对照组和COPD组膈肌细胞凋亡指数（AI）分别为（1.17±0.21）%和（15.46±1.53）%。COPD组膈肌细胞AI高于正常对照组（P<0.05），结果见表3。

2.5 慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌myostatin mRNA表达RT-PCR结果如图1显示，COPD组膈肌中myostatin mRNA表达较正常对照组增加，将图片进行灰度值分析，正常对照组和COPD组myostatin mRNA表达的灰度值分别为0.37±0.11和0.86±0.12，COPD组高于正常对照组（P<0.05），结果见表4。

图1 两组大鼠膈肌myostatin mRNA表达

表4 两组大鼠膈肌myostatin mRNA表达比较

2.6 慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌myostatin mRNA表达与膈肌重量和凋亡的相关性COPD组膈肌中myostatin mRNA表达与膈肌重量呈负相关（R2=0.784，r=-0.885，P<0.05），与膈肌细胞凋亡指数均呈正相关（R2=0.748，r=0.865，P<0.05），见图2。

图2 COPD组膈肌myostatin mRNA表达与膈肌重量（A）和凋亡（B）的相关性

3 讨论

COPD作为一种重要的慢性呼吸系统疾病，由于其缓慢进行性进展，严重影响患者劳动能力和生活质量。近年来COPD的发病率和病死率仍在持续上升，它的发病机制尚未完全阐明，并缺乏有效的治疗手段，对于临床医务工作者是一个巨大的挑战。吸烟是COPD重要的致病因素之一［8］，吸烟者COPD的发生率明显高于不吸烟者，戒烟是COPD治疗策略中关键的措施之一［9］。吸烟产生的有害气体或颗粒能引起异常的肺部炎症反应，主要通过损伤气道上皮细胞并影响纤毛运动，导致支气管杯状细胞增生，黏液分泌增多使得净化能力降低；吸烟还能抑制肺泡巨噬细胞吞噬功能，病原体更易于潴留于呼吸道内而引起炎症反应。此外吸烟还能引起氧化应激和蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，导致肺气肿的产生［10，11］。

在本研究中，我们通过5个月的长期烟雾暴露来复制COPD大鼠模型，接受烟雾暴露的大鼠逐渐出现精神萎靡、饮食进水减少、活动迟缓、毛发黄涩，呼吸频率加快，后期部分大鼠可见口鼻内分泌物，或出现烦躁不安等症状。造模后，COPD组大鼠体重明显低于正常。肺泡灌洗液中炎症细胞数量明显升高，表明气道腔和肺部存在以中性粒细胞及巨噬细胞为主的炎症反应，这与Vlahos等的研究报道一致［12］。表明我们的研究中香烟烟雾吸入成功复制COPD模型。

研究表明，凋亡在COPD发生发展的病理生理学过程中发挥重要的作用［13，14］，骨骼肌凋亡使得肌肉质量减少，从而引起肌肉萎缩。我们的研究表明，COPD大鼠的膈肌凋亡增加，质量减少，这与既往报道相符［15］。由此可见，膈肌细胞凋亡参与了COPD的发病过程，但具体机制目前尚不明确。肌肉生长抑制素主要作用是抑制肌肉的生长发育，有研究发现其基因敲除小鼠表现出肌肉增生肥大，而转基因小鼠则出现萎缩及恶病质［16］。我们的研究表明肌肉生长抑制素mRNA表达在COPD时明显升高。肌肉生长抑制素在正常时以无活性的形式存在，在缺氧、氧化损伤等情况下活化后高表达［17］，COPD时往往存在这些诱导肌肉生长抑制素高表达的危险因素。相关分分析结果提示COPD时膈肌肌肉生长抑制素mRNA表达与膈肌重量呈负相关，而与膈肌细胞凋亡指数呈正相关。因此，我们推测肌肉生长抑制素的高表达可能与膈肌细胞凋亡和萎缩有关，从而导致膈肌功能障碍而引起呼吸衰竭，参与COPD的发病过程。在COPD早期抑制肌肉生长抑制素的表达可能是一个有前途的预防或治疗COPD的措施。

综上所述，我们通过单纯熏香烟法成功建立了大鼠COPD模型，COPD大鼠膈肌肌肉生长抑制素mRNA表达增加，可能与促进膈肌细胞凋亡及萎缩相关。进一步探索肌肉生长抑制素在COPD中的作用和机制，能为COPD的防治提供新的靶点。