姜黄素逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药的机制研究

刘小平，王劲进，王铭远，2，柒铭铭，肖彩艳

（1.中南大学湘雅医学院附属株洲医院妇产科，株洲 412000，2.中南大学基础医学院病理生理学教研室，长沙 410008）

卵巢癌是全球女性最常见的妇科肿瘤之一，也是女性癌症死亡的第五个常见原因［1］，超过70%的卵巢癌患者确诊时即为晚期，死亡率居各类妇科肿瘤第二［2］。目前的治疗手段主要是手术切除，术后辅以放化疗等综合治疗，但化疗药物副作用大且易产生耐药性已成为卵巢癌治疗失败的主要原因之一［3］。紫杉醇是卵巢癌的一线化疗药物［4］，研究发现紫杉醇可促进卵巢癌细胞自噬，且自噬的激活可诱导卵巢癌细胞对紫杉醇耐药［5］。因此，寻找有效的耐药逆转剂已成为卵巢癌研究的热点和难点。姜黄素（Curcumin）是从姜黄根茎中提取的天然疏水性多酚化合物［6］，具有丰富的药理活性，尤其是抗肿瘤活性［7］。然而尚无文献报导姜黄素是否可以通过抑制人卵巢癌细胞自噬从而逆转紫杉醇耐药。本研究通过紫杉醇浓度梯度递增法诱导构建对紫杉醇耐药的人卵巢癌细胞株OVCAR3/T，探讨耐药细胞的生物学特性。并揭示姜黄素可能通过抑制自噬来发挥逆转卵巢癌细胞株 OVCAR3/T对紫杉醇的耐药作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药品包括姜黄素粉末（索莱宝，纯度95%），溶于二甲基亚砜（DMSO，索莱宝）中配置成50 mmol/L的母液；紫杉醇注射液（购自海南制药公司，6 mg/mL）；四甲基偶氮唑盐（MTT，索莱宝）溶于DMSO中配置成50 mmol/L的母液；RPMI1640培养基（Gibco公司）；10 %胎牛血清（BI公司）；青链霉素混合液（BI公司）；0.25 %胰蛋白酶（BI公司）；LC3兔抗人单克隆抗体（CST公司）；p62兔抗人单克隆抗体（CST公司）；β-actin兔抗人单克隆抗体（武汉谷歌生物公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体（碧云天）。

1.2 细胞株与细胞培养本实验使用的人卵巢癌细胞株OVCAR3由湖南师范大学医学院赠予；培养液为RPMI1640（含10% 进口胎牛血清、1%青链霉素混合液），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 耐药细胞株OVCAR3/T的建立OVCAR3/T为本实验组采用紫杉醇浓度梯度递增法诱导建立的卵巢癌耐药细胞株［8］，能在含紫杉醇浓度为0.1μg/L的培养基中长期稳定生长，并命名为OVCAR3/T。

1.4 MTT法检测卵巢癌细胞生长活力取对数生长期的OVCAR3和OVCAR3/T细胞接种在96孔板内，置于培养箱中24小时，用不同浓度的紫杉醇、姜黄素分别处理72小时。然后弃去孔内培养基，每孔中加入50μL MTT溶液，继续培养4 h后向每个孔中添加150μL DMSO，避光震荡15min，通过酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光度，计算出紫杉醇对两种细胞生存率的影响，姜黄素对耐药细胞生存率的影响，使用prism软件绘制MTT曲线。

1.5 平板克隆实验检测卵巢癌细胞集落形成能力取对数生长期的OVCAR3和OVCAR3/T细胞接种在24孔板中，置于培养箱中24小时，用不同浓度姜黄素分别处理7天。当细胞密度至70～80%时，取出24孔板，弃去培养基，用10%福尔马林固定3小时，每孔加1mL 0.1%结晶紫浸染1小时，浸染后用蒸馏水缓慢轻柔清洗，倒置在纸上干燥。放入酶标仪中，选择波长为550mm进行定量，分析不同浓度姜黄素对耐药细胞集落形成能力的影响，使用prism软件进行统计学分析。

1.6 RT-qPCR法检测两种细胞中自噬相关基因的表达差异、姜黄素对耐药细胞自噬相关基因的影响Trizol法提取OVCAR3和OVCAR3/T细胞总RNA，利用紫外分光光度计测试RNA纯度和浓度，RT-qPCR试剂盒逆转录制备 cDNA，进行PCR扩增。2-△△CT法计算mRNA的相对表达量，以β-actin为内参。每个实验组重复3次。引物序列见表1。

表1 各基因荧光定量PCR引物序列及产物长度

1.7 Western blot法检测两种细胞中自噬相关蛋白的表达差异、姜黄素对耐药细胞自噬相关蛋白的影响用RIPA细胞裂解液裂解各组细胞，BCA法检测蛋白质浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜上，加入一抗（1：1000）并于 4°C孵育过夜。PBST洗3次，二抗（1：1000）37° C孵育2h，再次PBST洗3次，室温封闭2h，用ECL增强化学发光显色系统显色。

1.8 统计学方法所有定量实验均重复3次，数据通过Prism进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OVCAR3/T的模型建立用不同浓度紫杉醇分别处理OVCAR3和OVCAR3/T细胞72h，卵巢癌细胞活力随姜黄素浓度增高而下降（见图1）。应用SPSS软件估算出紫杉醇对OVCAR3和OVCAR3/T的IC50值分别为0.477μg/L和3.279μg/L，根据公式耐药指数（resistance index，RI）=耐药株IC50/敏感株IC50，计算出RI为6.87（P<0.05）（表2）。

图1 不同浓度紫杉醇处理OVCAR3和OVCAR3/T细胞

表2 OVCAR3和OVCAR3/T细胞的IC50浓度

2.2 OVCAR3/T的生物特性

2.2.1 细胞形态学变化在倒置相差显微镜下观察，可见对照组OVCAR3细胞株贴壁良好，细胞呈梭形或多边形，少量圆形，胞体透亮，状态佳；而OVCAR3/T耐药细胞株贴壁较差，细胞形状不规则，圆形或椭圆形细胞增多，细胞折光性差，较暗，细胞内颗粒增多。

2.2.2 自噬相关基因和蛋白表达差异与OVCAR3相比，OVCAR3/T细胞中LC3表达增加，P62表达降低，无论在 mRNA水平还是蛋白表达水平OVCAR3/T细胞中自噬均增加（图2）。

图2 OVCAR3和OVCAR3/T细胞P62、LC3基因和蛋白表达水平

2.3 姜黄素使OVCAR3/T细胞活力下降用不同剂量的姜黄素处理OVCAR3/T细胞。结果表明，与空白对照组相比，卵巢癌细胞活力随姜黄素浓度增高、时间延长而下降（图3），差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.4 姜黄素抑制OVCAR3/T细胞集落形成能力使用Colony实验检测OVCAR3/T细胞的集落形成能力。与空白对照组相比，姜黄素处理后细胞的集落形成能力明显下降（图4）。结果表明，姜黄素可抑制人卵巢癌耐药细胞株的集落形成能力。

2.5 姜黄素可抑制OVCAR3/T细胞自噬RT-qPCR检测LC3、P62 mRNA表达，Western blot 检测LC3、P62蛋白表达。与空白对照组相比，姜黄素处理后的OVCAR3/T细胞，LC3 mRNA和蛋白表达量增加，P62 mRNA和蛋白表达量下降（图5）。结果表明，姜黄素可以抑制耐药株中自噬的表达。

2.6 姜黄素作用于耐药株使其对紫杉醇重新敏感用低浓度姜黄素（1μM）、紫杉醇（0.1μg/L）及姜黄素+紫杉醇分别作用于耐药株24h，发现联合用药显著降低细胞活力（图6）。

图6 姜黄素、紫杉醇单药及联合用药作用于耐药细胞

3 讨论

肿瘤化疗耐药一直是癌症治疗中的难点，大量研究表明肿瘤化疗耐药与自噬相关［9］。研究发现，紫杉醇耐药与多药耐药蛋白［10］、微管蛋白［11］及细胞凋亡［12］等有关。然而，紫杉醇耐药机制繁冗复杂，其分子机制还不十分清楚。

自噬在肿瘤的发生发展中具有两面性［13］，在肿瘤形成初期，自噬通过降解受损细胞器以修复变异细胞，此时自噬具有肿瘤抑制作用［14］；在饥饿、低氧等应激情况下，自噬使营养缺乏的肿瘤细胞通过降解部分自身物质以满足维持生存所需，促进肿瘤细胞存活，即保护性自噬［15］。研究发现紫杉醇可诱导卵巢癌细胞自噬，并且紫杉醇诱导的自噬激活对卵巢癌细胞起到保护作用，是其产生耐药的原因之一［5］。在多种肿瘤中也发现，自噬高表达与化疗耐药［16］、不良预后［17］显著相关。而姜黄素是广谱抗癌药物，已有研究表明姜黄素可逆转卵巢癌细胞化疗耐药［18］，但其具体机制仍有待进一步研究。因此，本研究就姜黄素在耐药细胞株OVCAR3/T中的作用及具体机制进行研究。

本研究成功建立对紫杉醇耐药的人卵巢癌细胞株OVCAR3/T。相比于敏感细胞，耐药细胞形态不规则，自噬表达增加。本实验结果表明姜黄素呈时间、浓度梯度依赖性抑制耐药细胞生长，姜黄素处理后的耐药细胞自噬表达呈剂量依赖性降低，并且我们发现无毒剂量姜黄素作用于耐药细胞后使其对紫杉醇重新敏感。 综上，姜黄素抑制耐药株OVCAR3/T的生长和增殖，逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药，其机制可能与抑制自噬的表达有关。姜黄素有望成为有效的逆转卵巢癌耐药的抗肿瘤药物。