TGF-β、内质网应激cross-talk在肺癌细胞上皮间质转化 机制中的作用

王 涛，高 峰，王 瑞，米丽丽，张泽峰

（河北医科大学第四医院胸一科，石家庄 050000）

肺癌是常见恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率，近年来肺癌发病呈逐年增长趋势，早预防、早发现、早治疗是控制肺癌进展关键［1］。由于肺癌早期症状不典型，引起肺癌早期诊断困难，导致部分患者确诊时已是肺癌中晚期，甚至出现远处转移，严重增加临床治疗难度和影响患者临床预后［2］。肺癌的转移、复发与上皮细胞间质化（EMT）存在密切关系，EMT是指在某些特定的情况下上皮细胞的生理、病理状态以及细胞形态向间充质细胞转化，细胞间的附着能力减弱，更容易转移［3］。转移生长因子β（TGF-β）家族是一类具有旁分泌和自分泌功能的细胞因子，具有5类亚型并参与细胞多种生理功能。TGF-β1可广泛分布于细胞、组织器官中，已有研究［4-5］表明口腔鳞状细胞癌组织中心和浸润前沿均呈高表达，与肿瘤浸润深度和神经侵犯呈正相关，还能促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移，体外细胞实验［6-8］表明TGF-β1还能诱导乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞EMT。肿瘤细胞EMT发生受到多种因素的影响，有研究表明［9］内质网应激（ER stress）可以参与肿瘤进展，诱导肿瘤细胞EMT、自噬，增强肿瘤细胞侵袭和耐药。但有关TGF-β1、ER stress在肺癌EMT之间cross-talk的研究报道较少，本研究旨在探讨TGF-β1和ER stress在肺癌细胞EMT中的cross-talk，希望为临床肺癌药物研发提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 实验材料肺癌A549细胞系购自上海邦景实业有限公司。TGF-β1（纯度>90%）购自南京欧凯生物。4-PBA（纯度>98%）购自美国MedChemExpress LLC。丝氨酸苏氨酸激酶（AKT）抗体购自武汉益普生物科技有限公司。兔抗人磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、X盒集合蛋白1s（XBP-1s 1s）抗体购自上海科敏生物科技有限公司。ECL Kit购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco BRL。HRP标记羊抗兔二抗IgG、Trizol总RNA提取试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit购自上海翊圣生物科技有限公司。SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自上海沪震实业有限公司。Lightcycle 480实时定量PCR仪购自罗氏诊断。CO2培养箱购自美国REVCO。高速冷冻离心机购自美国Beckman Coulter。荧光显微镜购自德国徕卡。所用引物均有上海·生工提供。

1.2 细胞培养肺癌A549细胞置于PRMI 1640培养液（10%胎牛血清、100U/L青霉素和100mg/L链霉素）37℃、5%CO2饱和湿度恒温孵箱中培养，培养至对数期，然后以1：4进行传代培养，取第3代细胞用于后续实验。

1.3 细胞分组和处理将肺癌A549细胞接种至灭菌培养皿中，培养条件同1.2，待生长至60%时加入不同浓度的TGF-β1（0、2.5、5、10 ng/mL）［10］处理，继续孵育24 h，在显微镜下观察细胞形态变化，细胞形态拉长且细胞间连接变得疏松说明细胞发生EMT。将肺癌A549细胞分为对照组、TGF-β1组、4-PBA组、联合组，培养条件同上，待生长至60%时，待生长至60%时，TGF-β1组、4-PBA组、联合组分别给予TGF-β1、4-PBA、TGF-β1+4-PBA处理，使其最终浓度分别为TGF-β1 10 ng/mL、4-PBA 10 mM、TGF-β1 10 ng/mL+4-PBA 10 mM，对照组给予等体积DMSO处理，继续孵育24 h，用于后续实验检测。

1.4 transwell实验将60μL Mateigel加入300μL无血清培养基混合均匀，加入100μL至上室膜包被，37℃孵育4 h，然后将1.3中对照组、TGF-β1组、4-PBA组、联合组中的细胞接种至上室小孔（4×104/孔），下室加入600μL 含10%FBS培养基，作为趋化因子，1.2孵育条件继续孵育24 h，棉签擦除膜表层细胞，%甲醇固定底层细胞，%结晶紫染色20 min，高倍镜下观察5个不重叠视野，统计穿膜细胞数目，求其均值作为该组结果。实验重复3次。

1.5 Western-blot检测蛋白表达提取1.3中对照组、TGF-β1组、4-PBA组、联合组细胞总蛋白，Bradford调整各组提取蛋白浓度一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人GRP78、XBP-1s、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K、GAPDH抗体（1∶500）4℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入HRP标记二抗（1：500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，曝光显影，系统自带软件分析蛋白相对灰度值。实验重复3次。

1.6 RT-PCR检测基因水平取1.3中对照组、TGF-β1组、4-PBA组、联合组细胞，采用RNA纯化试剂盒提取细胞总RNA，并反转录合成cDNA作为PCR扩增模板，扩增程序设置为95℃预变形3min、95℃变性10s、56℃退火30s、72℃延伸10 s，34个循环，选用U6作为看家基因，使用2－ΔΔCt［11］法分析基因相对水平。重复3次。

1.7 统计分析数据统计分析软件使用SPSS 22.0，柱状图绘制软件采用GraphPad Prism 6.0，数据表示为平均值±标准差，组间比较采用t检验，P<0.05表示存在统计差异。

2 结果

2.1 TGF-β1对肺癌A549细胞EMT的影响 TGF-β1处理下的肺癌A549细胞EMT形状发生梭状变化、细胞松散分布，随着TGF-β1作用浓度升高，细胞散乱分布情况越明显（图1）。

图1 各组细胞EMT情况

2.2 TGF-β1对肺癌A549细胞侵袭的影响 与对照组相比，TGF-β1组细胞侵袭数目升高（P<0.05），4-PBA组细胞侵袭数目降低（P<0.05）；与TGF-β1组相比，联合组细胞侵袭数目降低（P<0.05）（图2）。

图2 各组细胞侵袭情况

2.3 各组细胞EMT相关基因水平比较与对照组相比，TGF-β1组N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平升高（P<0.05），E-cadherin mRNA水平降低（P<0.05）；与对照组相比，4-PBA组N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平降低（P<0.05），E-cadherin mRNA水平升高（P<0.05）；与TGF-β1组相比，联合组N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平降低（P<0.05），E-cadherin mRNA水平升高（P<0.05）（表1）。

表1 各组细胞EMT相关基因mRNA水平比较

2.4 各组细胞ER stress相关基因蛋白水平比较与对照组相比，TGF-β1组GRP78、XBP-1s蛋白水平升高（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平升高（P<0.05）。与对照组相比，4-PBA组GRP78、XBP-1s蛋白水平降低（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平降低（P<0.05）；与TGF-β1组相比，联合组GRP78、XBP-1s蛋白水平降低（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平降低（P<0.05）（图3、表2）。

图3 各组细胞GRP78、XBP-1s蛋白表达

表2 各组细胞ER stress相关基因蛋白水平比较（n=3）

2.5 各组细胞PI3K/AKT途径相关蛋白水平与对照组相比，TGF-β1组p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平升高（P<0.05），4-PBA组p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平降低（P<0.05）；与TGF-β1组相比，联合组p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平降低（P<0.05）（图4、表3）。

图4 各组细胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白表达

表3 各组细胞ER stress相关基因蛋白水平比较

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率均位居所有恶性肿瘤首位［12］，肿瘤细胞EMT是恶性肿瘤出现侵袭、转移的重要作用机理，肿瘤细胞通过EMT获得间质细胞形态和侵袭能力，可容易穿透基底膜进入肿瘤组织相邻周围组织，实现肿瘤细胞侵袭、迁移［13］。TGF-β1属于具有自分泌、旁分泌功能的TGF-β超家族成员，可促进肝星状细胞合成纤维连接蛋白、I型和IV型胶原，有利于细胞外基质合成，同时还可通过增强Smad信号诱导肺癌细胞EMT［14］。本研究结果发现随着TGF-β1作用剂量增加，肺癌A549细胞的EMT现象更加显著，证实TGF-β1确实可以诱导肺癌A549细胞EMT。

EMT发生机制较为复杂，近年来有学者认为肿瘤细胞MET可能与肿瘤微环境有关，其中ER stress可参与肿瘤细胞EMT过程［15］。ER stress是指由各种因素引起的内质网内的未折叠、错误折叠蛋白聚集，导致内质网功能紊乱，影响蛋白质合成，使未折叠蛋白反应激活［16］。本研究结果发现给予TGF-β1处理可以提高肺癌A549细胞的侵袭数目，而给予ER stress抑制剂4-PBA处理可以降低肺癌A549细胞侵袭数目，说明TGF-β1可以提高肺癌A549细胞的侵袭能力，给予ER stress抑制剂干预可以抵消部分TGF-β1促侵袭作用。本研究还发现TGF-β1处理能够升高N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平，降低E-cadherin mRNA水平，而4-PBA处理后上述指标的mRNA水平呈相反趋势。E-cadherin对维持上皮细胞表型具有重要作用，可通过胞外的免疫球蛋白结构域使各分子间产生相互连接，同时经过胞内α、β连接素和肌动蛋白骨架连接，最终形成稳定的胞间接触，E-cadherin表达异常直接影响细胞的粘附能力［17］。N-cadherin在调节细胞间的粘附能力方面呈现出相反趋势，当恶性肿瘤出现侵袭、迁移，其表达量升高。Vimenti属于中间丝蛋白质，与微管、肌动蛋白微细丝共同组成细胞骨架。Snail是含有特殊结构的DNA结合蛋白，能识别E-cadherin启动子并在E-box部位结合，抑制E-cadherin转录。柳惠斌等［18］研究表明肺腺癌细胞TGF-β1阳性表达显著，可以通过诱导细胞EMT增强细胞侵袭、迁移能力。本研究结果也出现趋势，说明TGF-β1诱导肺癌A549细胞EMT增强细胞的侵袭能力，同时也提示TGF-β1诱导肺癌A549细胞EMT作用机制可能与细胞的ER stress有关。

内质网是细胞合成、加工、修饰蛋白以及钙离子存储场所，当受到自由基、药物刺激、感染时，未折叠蛋白、错误折叠蛋白均会堆积于内质网，诱发R stress。GRP78、XBP-1s是ER stress的标志性蛋白，在多种肿瘤组织中呈高表达，还与肿瘤的恶化程度、侵袭存在相关性。本研究结果显示TGF-β1处理可以提高GRP78、XBP-1s蛋白表达和基因水平，而给予4-PBA处理可以降低该趋势。Shin等［19］研究表明4-PBA能够降低TGF-β1诱导的ER stress标志物水平，本研究结果也出现相似趋势，说明TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT可能通过ER stress发挥作用。本研究结果还发现TGF-β1处理可以升高肺癌A549细胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平，4-PBA处理趋势相反。Ak、PI3K对抗细胞凋亡具有促进作用，已有研究［20］表明TGF-β1诱导细胞EMT是通过调节PI3K/Akt途径实现的，本研究结果也呈相似趋势，说明TGF-β1诱导肿瘤细胞EMT与影响PI3K/Akt信号通路活性有关。

综上所述，本研究主要是通过细胞体外实验证明TGF-β1可诱导肺癌A549细胞EMT，其一部分作用机制可能是通过介导ER stress发挥促EMT作用，而在动物体内是否存在相似趋势需要后续通过构架突变体小鼠给予探索。