参奇颗粒对心肌缺血再灌注损伤的保护作用①

宋琳琳，赵 岩，沈德凤，赵 宏

(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

随着人们生活水平和方式的改变，心血管疾病的发病率及死亡率逐年增加[1]。近年来，随着介入手术、溶栓治疗及冠状动脉旁路手术的应用，它在局部缺血的治疗、心肌灌注的恢复、心功能的维持等方面发挥了重要的作用，心肌缺血再灌注损伤作为临床常见并发症之一，严重影响患者治疗效果及生命健康[2]。因此如何减轻心肌缺血再灌注损伤是医学领域的重要课题，阐明其机制也具有重要意义。

参奇颗粒是由黄芪、玉竹和沙参等组成的复方制剂。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，具有调节免疫活性，清除氧自由基，抗氧化和抗肿瘤的药理作用[3,4]，研究证实，黄芪多糖具有明显的心肌保护作用[5]，对心肌缺血再灌注损伤也有一定的保护作用[6,7]。玉竹white百合科黄精的干燥根茎，多糖是玉竹的主要活性成分，其生理活性显著，具有降血压、降血脂、改善心肌缺血的作用[8]。北沙参与黄芪等药材进行配伍，通过静脉注射用以治疗病毒性心肌炎，呈现出较好的治疗作用[9,10]。已有研究表明复方参奇颗粒对心肌缺血再灌注损伤中的保护作用尚未充分研究，对其抗缺血再灌注损伤的保护作用机制尚未阐明。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HH80型恒温水浴锅(常州亿能实验仪器厂)；JA1003型电子分析天平(上海方瑞仪器有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-755B型紫外分光光度计(日本岛津)；RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣有限公司)；80-1型离心沉淀机(科大创新公司)；电子恒温箱(北京福意电器有限公司)；DW-3000型小动物人工呼吸机(北京众实迪创科技发展有限公司)，CYX41型倒置生物显微镜(Olympus公司)。

1.2 药物

参奇颗粒(自制)，药材从黑龙江省佳木斯市民生药店购买，并由佳木斯大学药学院生药学教研室鉴定。

1.3 试剂

化学试剂均为分析纯；水为蒸馏水；伊文氏蓝、磷酸缓冲液(PBS)购自Sigma公司；无水乙醇购自哈尔滨第一化学试剂有限公司；水合氯酸购自国药集团化学试剂有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-PX、髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；TUNEL凋亡检测试剂盒购自北京凯瑞基生物有限公司。

1.4 实验动物

50只清洁级健康昆明种大鼠雌雄各半，由佳木斯大学动物实验中心饲养并提供，每只体重在180～220g左右，合格证号SCXK(黑)2013-001，自由饮水和喂食。

2 方法

2.1 参奇颗粒的制备

用纯化水按照一定比例煎煮黄芪、玉竹和沙参等药材2次，乙醇沉淀后，浓缩成浸膏，取清膏1份、蔗糖粉3份、糊精1.25份、乙醇适量制成颗粒，干燥即得参奇颗粒。

2.2 参奇颗粒对心肌缺血再灌注损伤的药效学研究

动物分组与造模：将50只昆明种大鼠随机分为5组，每组10只，分为假手术组、模型组、高、中、低剂量参奇颗粒组，分别以10、15、20mg/kg不同剂量参奇颗粒水溶液连续灌胃14d，1次/天。假手术组给予相同量的生理盐水，而假手术组只打开胸腔不结扎冠状动脉。

采用冠脉结扎手术造模[11,12]，末次灌胃给药后禁食不禁水，12h后以6mL/kg腹腔静脉注射10%水合氯醛给大鼠麻醉，麻醉后，将大鼠固定在手术板上，处于仰卧位，手术部位毛发被剪断，在颈部气管插管。气管切开后，连接了一个小动物呼吸机，呼吸模式为HFJV，呼吸频率为70次·min-1，打开左胸骨，切开第四肋骨打开胸腔，暴露心脏，打开心包，将一根针插入左心房左心耳下的左下冠状动脉，深度约1mm，形成一个松散的结，在结扎线下放置2mm胶管，收紧结扎线以形成结扎线。造成急性心肌缺血模型。根据实验设计，分别建立心肌缺血(缺血30min)和缺血/再灌注损伤(再灌注2h)模型，再灌注结束时，采集腹主动脉血液，快速取出心脏以确定梗死面积。血清在-80℃冰箱中冷冻保存。

3 结果

3.1 心电图的测定

将大鼠的四肢固定后持续检测小鼠的心电图，分别记录各组大鼠造模后5min、15min、25min、35min 时心电图心率变化。 见表1。

表1 参奇颗粒对大鼠心肌缺血时心率的影响

采用冠脉结扎手术造模，促使大鼠冠状动脉左前降支造成缺血，肉眼见左室前壁局部呈现苍白或紫绀，由表1可以看出，造模成功后5、15、25、35min， 与假手术组相比，模型组心率显著加快(P<0.01) ， 表明心肌缺血模型成功；然后迅速将结扎线松开后松开，大鼠心脏恢复血流，观察出缺血区发白的心肌逐渐转为红润，即缺血再灌注手术成功。与模型组相比，参奇颗粒低、中、高剂量组心率均明显改善， 且具有显著差异(P<0.01或P<0.001)。

3.2 参奇颗粒对大鼠血清相关生化指标的检测

各组大鼠经腹主动脉采血后，2000r/min离心10min，分离血清，按试剂盒说明书测定SOD活性、MDA含量及GSH-PX含量。见表2。

表2 参奇颗粒对大鼠血清GSH-PX含量、MDA含量及SOD活性的影响

活性氧的产生是引起缺血再灌注损伤的主要诱因，测血清中SOD、MDA和GSH-Px水平含量可作为评估参奇颗粒保护心脏的作用的机制的重要指标。如表2所示，与假手术组比较，模型组能显著升高大鼠心肌血清中GSH-PX、SOD活性(P<0.05，能降低大鼠血清中MDA活性(P<0.05)； 与模型组比较，参奇颗粒低、中剂量组均能升高大鼠血清中GSH-PX活性(P<0.05)，参奇颗粒高剂量组能显著升高大鼠血清中GSH-PX活性(P<0.01)；参奇颗粒高、中、低剂量组均能降低大鼠血清中MDA活性(P<0.01)，并且差异显著；参奇颗粒低剂量组能升高大鼠血清中SOD活性(P<0.05)，参奇颗粒中、高剂量组能显著升高大鼠血清中SOD活性(P<0.01)。

3.3 参奇颗粒对大鼠心肌MPO活性的测定

取大鼠一小部分心脏，生理盐水清洗后，制成匀浆，3000r/min离心10min取上清。检测MPO活性，具体步骤按试剂盒说明书进行，比色法测定分光光度计460nm处A值，计算MPO活性。见表3。

表3 参奇颗粒对大鼠心肌MPO活性的影响

与假手术组比较，模型组能够显著升高大鼠心肌MPO活性(P<0.01)；与模型组比较，参奇颗粒低、中剂量组能够降低大鼠心肌MPO活性(P<0.05)，参奇颗粒高剂量组能够显著降低大鼠心肌MPO活性(P<0.01)。

3.4 参奇颗粒对大鼠心肌梗死面积(MIS)的测定

采用伊文氏蓝/TTC双染色法，在采集血清后将大鼠心脏取出，用磷酸缓冲液(PBS)清洗后并冻存(-20℃)，30min后取出，去除心房、血管及脂肪组织，从心尖起将心室平行切出相等厚度的片状物，并在37℃染色15 min。拍照后，切片中被染成红色的区域为正常组织，白色区域为坏死组织，通过软件 Image Pro Plus 6.0测算梗死区面积和心室总面积，计算MIS[8]。MIS/% = (梗死区面积/心室区总面积)×100%，见表4。

表4 参奇颗粒对缺血再灌注大鼠MIS的影响

假手术组大鼠心肌染色正常，无白色区域，表明假手术组心肌无梗死现象；模型组可见大面积灰白色区，心肌梗死程度严重。假手术组MIS为0，未纳入统计学比较；模型组大鼠MIS达31.51%，参奇颗粒高、中、低剂量组可分别使MIS缩小至17.60%、19.33%和22.32%，与模型组比较，给药组低剂量组均能够降低心肌梗死程度差异显著(P<0.05)，给药组中、高剂量组能显著降低心肌梗死程度差异显著(P<0.01)，起到保护心肌的作用，且呈剂量依赖性。

3.5 参奇颗粒对大鼠心肌细胞凋亡率的影响

釆用TUNEL染色法检测心肌缺血再灌注后心肌梗死部位心肌凋亡细胞的分布情况。心肌细胞经预处理后，按试剂盒说明书在光学显微镜下观察并记录心肌细胞及凋亡细胞的数目。正常细胞核呈深蓝色，阳性凋亡细胞核呈棕黄色，计算心肌细胞凋亡指数。心肌细胞凋亡指数/% = (心肌凋亡细胞数/计数细胞数)×100%，见表5。

表5 参奇颗粒对大鼠心肌细胞凋亡率的影响

在假手术组心肌组织中只能看到少量游离的凋亡细胞出现，而在心肌缺血部位，可见较多数量的棕黄色细胞核出现。通过计算心肌细胞凋亡指数，发现模型组凋亡指数与假手术组比较显著升高，而给予参奇颗粒低、中、高剂量组与模型组相比，阳性细胞核显著减少，且具有显著差异(P<0.01) ，表明证实了参奇颗粒可减少缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡。

4 讨论

缺血再灌注损伤的作用机制非常复杂并且其影响缺血再灌注损伤的因素也较多，据研究报道，其主要机制包括以下几方面，主要有氧化应激、细胞调亡、炎症、神经细胞内的钙超载和以及细胞毒性物质等。尤其是氧化应激作用在心肌缺血再灌注损伤中起到及其重要的作用，当机体遭受各种有害刺激时，产生氧化应激反应，体内的活性自由基大量增加，超出机体的正常清除能力，导致体内氧化系统紊乱，产生脂质过氧化作用和过氧化产物，导致组织损伤。研究表明，在刚开始进行缺血再灌注后，心肌细胞会促使体内可产生大量的活性氧，活性氧增多将导致SOD和GSH-PX等重要自由基清除酶消耗增加，生成减少。最终引起心肌损伤和心肌细胞死亡。因此，心肌细胞的抗氧化作用可以通过减少体内产生的活性氧，从而减轻心肌细胞在缺血再灌注后对机体的损伤。通过上述实验数据可以发现，参奇颗粒可以使SOD和GSH-PX活性增强，以此来减轻体内的氧化损伤，以及通过MDA含量的降低，来发挥药物对心肌细胞的保护作用。 综上所述，参奇颗粒对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，但单纯从过氧化反应似乎不能解释缺血再灌注病理发展的全过程，其保护作用是否与抑制致炎细胞因子有关，值得进一步研究。