基于网络药理学的健脾消积方治疗肝癌的作用机制研究*

谢小慧，韩志伟，王宗玉，陈欣欣，仇雯霞，陈 闯△

（1.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023；2.广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021；3.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

根据国家癌症中心发布的调查数据显示，肝癌发病率在我国癌症发病率中排第5 位，死亡情况排在第2 位，是威胁我国人民生命健康和影响生活质量的重大疾病[1]。肝癌的发生发展是多种因素综合作用的结果，因此如何控制肝癌的生长与转移，是目前治疗肝癌主要的研究方向和急需解决的问题。通过近年来的研究发现，越来越多的中草药被发现有一定的抗肿瘤治疗效果，临床上也常用来辅助化疗和提高肿瘤患者的身体抵抗力[2]。健脾消积方是本院对肝癌进行研究的主要方剂，同时也是我科在临床上用于治疗肝郁脾虚证的经验方，该方由黄芪、太子参、薏苡仁、茯苓、枳壳、莪术、麦芽、白花蛇舌草、青皮、陈皮、白术11 味中药组成疗效确切，可改善肝癌晚期患者的临床症状，缓解疼痛，提高患者的生活质量[3]。体外实验研究证实健脾消积方水提物可以抑制肝癌细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡[4]，但其药效物质基础及分子作用机制尚不清楚。因此，本文拟用网络药理学的分析方法来研究健脾消积方治疗肝癌的药效物质基础和作用机制，以期为健脾消积方的临床应用提供理论基础和依据。

1 资料与方法

1.1 健脾消积方活性化合物及靶点筛选 本研究将健脾消积方的组成药物黄芪、太子参、薏苡仁、茯苓、枳壳、莪术、麦芽、白花蛇舌草、青皮、陈皮、白术为关键词输入中药系统药理学数据库TCMSP（2.3 version，https://tcmspw.com/tcmsp.php），结合中药发挥药效在人体会经过吸收分布代谢和排泄的过程，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为筛选标准，选取化合物和靶点[5]。再将获得的靶点蛋白名导入到uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）当中，设置物种为“Homo sapiens”获取标准基因名，获取日期为2021年3月。

1.2 健脾消积方治疗肝癌的关键靶点筛选 在OncoDB.HCC 数据库(http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/)和Livercome 数据库(http://liverome.kobic.re.kr/)中检索获取肝癌相关作用靶点，检索日期为2021年3月。并将获得的疾病靶点和“1.1”项中获得的化合物靶点导入Venny（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）当中，取交集得到健脾消积方治疗肝癌的潜在作用靶点。

1.3 “化合物－靶点”网络连接构建 将健脾消积方治疗肝癌的关键靶点和相对应的化合物在excel表格中整理后导入Cytoscape3.7.0软件作图，并使用Network Analyzer插件进行分析。

1.4 关键靶点相互作用网络图构建 将健脾消积方和肝癌的共同靶点导入STRING（11.0 version，https：//string-db.org）数据库中，选择“Homo sapiens”为研究物种，在设置栏目当中将置信度设置为默认的“medium confidence0.4”，剔除无相互连接的蛋白，将结果以TSV 格式保存，导入Cytoscape3.7.0 分析作图，得到关键靶点蛋白质相互作用（PPI）网络图。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析 通过高通量的生物数据功能分析挖掘工具DAVID 数据库（6.8 version，http://david.nifcr.gov/)对健脾消积方得到的关键靶点进行基因功能GO富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.001 为筛选标准，导入Excel表格整理作图可视化。

1.6 “成分－关键靶点－通路”网络图绘制 筛选“1.5”项中通过关键靶点进行KEGG 富集分析得到的信号通路，结合“1.4”项中的PPI 网络构建筛选出来的前15 个关键靶点和“1.3”项中获得的成分，绘制“成分－关键靶点－通路”网络图。

2 结果

2.1 健脾消积方化学成分和靶点 在TCMSP 数据库中以OB≥30%，DL≥0.18 为基准筛选健脾消积方各成分，去除无靶点预测的化合物，得到黄芪化合物有16 个、太子参有6 个、薏苡仁有6 个、茯苓有6个、枳壳有5个、莪术有1个、麦芽有15个、白花蛇舌草有5 个、青皮有5 个、陈皮有5 个、白术有4 个。将得到的中药化合物合并去重，最终得到58个化合物和205个靶点。

2.2 健脾消积方治疗肝癌的共有靶点 通过数据库中检索得到肝癌相关靶点503个。将健脾消积方化合物对应的205个靶点和肝癌相关的503个靶点合并去重，得到62 个健脾消积方作用于肝癌的靶点。

2.3 “化合物—靶点”网络构建 将健脾消积治疗肝癌的62个共有靶点以及作用于这些靶点的44个化合物导入Cytoscape 中构建网络互作图，见图1。结果显示，网络中的节点数为106个，相互连接的边的数目为223条。两个节点之间连接的边数代表度值（degree），节点与节点连接的边数越多degree 值越大，相应的该节点在该网络中的地位越重要。其中，degree 值排名靠前的化合物有槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin），degree值分别为23、23、11。这些化合物很可能是健脾消积方治疗肝癌的主要药效物质。

图1 健脾消积方化合物－靶点网络图

2.4 PPI网络构建 将健脾消积方可能治疗肝癌的62 个共有靶点导入STRING 数据库，再将STRING数据库得到的靶点互作数据以excel 表格形式导入Cytoscape 软件分析可视化，见图2。网络拓扑参数结果显示，该网络的平均degree 值为25.42，平均介数（betweeness)为0.01，平均接近中心性(closeness)为0.632 5，其中，degree、betweeness 和closeness 都超过平均值且排在前15 位的蛋白有TP53、EGFR、VEGFA、MYC、CASP3等，见表1。这些蛋白很可能是健脾消积方治疗肝癌的关键靶点。

表1 健脾消积方治疗肝癌关键靶点基本信息

图2 健脾消积方治疗肝癌PPI靶点图

2.5 健脾消积方治疗肝癌GO富集分析 为了研究健脾消积方治疗肝癌靶点参与的生命过程，本研究将健脾消积方和肝癌共有的62个靶点导入David数据库进行GO 富集分析，GO 富集分析包括三部分，生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。根据富集的靶点基因数（genecount)从大到小进行排序并选取前10 条进行绘图。该网络主要的BP 涉及细胞凋亡的调控（regulation of apoptosis）、细胞增殖的调控（regulation of cell proliferation）、细胞内信号级联（intracellular signaling cascade）等，CC主要涉及细胞核（nucleus）、细胞质（cytoplasm）、质膜（plasma membrane）等，MF 主要涉及蛋白质结合（identical protein binding）、核苷酸结合（nucleotide binding）、蛋白质二聚活性（protein dimerization activity）等，见图3。

图3 GO富集分析

2.6 健脾消积方治疗肝癌的KEGG 通路分析 取PPI 网络中的前15 个蛋白进行KEGG 通路富集分析，结果发现，15 个关键蛋白靶点富集在63 条通路上，其中P＜0.001 显著富集的有37 条通路，选取与肝癌相关的前10 条信号通路进行绘图。15 个关键靶点显著富集在与肝癌相关的通路上，如PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、P53信号通路等，见图4。

图4 KEGG富集分析

2.7 “成分－关键靶点－通路”网络构建 利用Cytoscape 3.7.0 软件绘图，槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin）这3 个化合物涉及的关键靶点数目最多，健脾消积方可能主要是由这3个成分来发挥药效的。这些化合物同时又通过CASP3、EGFR、TP53 等多个靶点协同作用于PI3KAkt、TP53、MAPK等多条信号通路，见图5。

图5 健脾消积方成分－关键靶点－通路网络图

3 讨论

本研究运用网络药理学的方法筛选出了健脾消积方治疗肝癌可能的中药成分和作用靶点，并对其可能的作用机制进行了探索。通过构建“化合物－靶点”网络图，健脾消积方中度值靠前的化合物有槲皮素、木犀草素、柚皮素等，这些成分可能是健脾消积方主要的药效成分。

通过构建PPI 网络可知，degree、betweeness 和closeness 都超过平均值的蛋白有TP53、CASP3 等，这些靶点可能是健脾消积方作用于肝癌最为关键的靶点。TP53 作为一种多功能转录因子，控制着DNA复制和修复、对维持基因组的稳定性以及与细胞周期进展和程序性细胞死亡密切相关[6]。有研究表明，TP53的激活可以调控MicroRNA的表达从而影响肝癌的细胞周期进展，增殖、凋亡和上皮-间质转化[7]。CASP3 是Caspase 家族中与细胞凋亡关系最密切的蛋白酶，在所有与细胞凋亡的激活和执行有关的蛋白质中，发挥着不可替代的作用[8]。CASP3 在肝癌组织中低表达可以抑制细胞凋亡[9]。另有研究表明，许多中药及其提取物可上调CASP3在肝癌细胞中的表达从而诱导细胞凋亡[10]。

本研究将前15 个关键靶基因进行KEGG 富集分析，发现健脾消积方治疗肝癌主要涉及PI3KAkt、P53 等信号通路。其中，PI3K/Akt 信号通路的作用包括促进细胞的生长、迁移、促进细胞的增殖和生存、促进血管生成以及下调周期抑制性调控因子等，在肝癌的发生发展中起着重要的作用[11]。有研究表明，槲皮素可以通过刺激AKT/mTOR通路诱导细胞自噬从而诱导肝癌细胞凋亡[12]。木犀草素可以通过PI3K/Akt 通路抑制HepG2 细胞的侵袭[13]。柚皮素可以通过PI3K/Akt/ERK 等信号转导途径抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[14]。p53 是重要的肿瘤抑制因子，通过刺激p53 信号通路可以激活其下游Caspase-3、Bax 等因子的表达从而引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡[15]。有研究报道，槲皮素可以抑制大鼠肝癌细胞的生长，增殖、阻滞其细胞周期进程，从而诱导凋亡。其机制可能与调控p53 和CASP3蛋白的表达有关[16]。Yee等[17]研究发现，木犀草素可以抑制肝癌细胞的增殖，将其阻滞于细胞周期G1期从而诱导细胞凋亡，并发现其机制可能与p53 信号通路的调控有关。柚皮素通过抑制HepG2 细胞增殖和诱导凋亡从而抑制HepG2细胞的生长，其机制与增加Bax/Bcl-2的比值、释放细胞色素C和上调p53、Caspase-3的表达，激活线粒体介导的凋亡途径有关[18]。进一步通过构建“成分－关键靶点－通路”网络图分析发现，槲皮素、木犀草素和柚皮素涉及的关键靶点数目最多，且这3 个成分的共有靶点为CASP3，结合PPI网络和KEGG富集分析结果，笔者推测，健脾消积方可能主要是通过PI3K/Akt通路调控下游的TP53，再作用于TP53 信号通路的CASP3蛋白，从而诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌的进展。

中药复方发挥疗效的机制复杂，本研究通过网络药理学的方法预测了健脾消积方的主要起效成分，关键靶点和关键的信号通路，体现了健脾消积方治疗肝癌多成分、多靶点、多通路综合作用的特点。但健脾消积方治疗肝癌的作用机制是否与网络药理学预测的结果一致，未来需要进一步的体内和体外实验验证。