持续隐匿性乙肝病毒感染树鼩肠道菌群变化研究*

陈秀娟，李科志，唐艳萍，涂 鑫，骆成飘，欧 超，曹 骥，杨 春△

（广西医科大学附属肿瘤医院 1.实验研究部；2.病理科；3.检验科,南宁 530021）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是威胁人类健康的全球性问题，若不及时、规范治疗，可能会产生乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等并发症，严重时危及生命。隐匿性HBV 感染（OBI）是指血清乙肝表面抗原阴性、肝组织存在具有复制能力的HBV DNA，伴或不伴有血清HBV DNA阳性[1]。根据HBV血清学标志物特点，OBI 可分为血清抗体阳性型（HBcAb阳性伴或不伴HBsAb 阳性）和血清抗体阴性型（HBcAb、HBsAb 均阴性）。自1978 年Hoofnagle等[2]首次报道了输注HBsAg（-）/抗-HBc（+）血液引起受血者HBV持续感染，OBI越来越受到人们的关注。

树鼩（tree shrew）是一种小型实验动物，已广泛应用于多种病毒感染性疾病研究，如HBV、流感病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒71 型、轮状病毒等[3]。本课题组前期建立了实验室人工繁育树鼩的基本方法，用培育的树鼩幼崽接种HBV，逐步证实HBV 能在树鼩体内复制，建立一过性感染、急性感染、隐匿性感染、慢性感染等不同HBV 感染状态模型[4-5]。肠道菌群是指在肠道定居并生长的微生物群落，其在维持宿主的新陈代谢、免疫功能等方面发挥重要作用。有研究表明，肠道菌群失调与宿主多种疾病有关，如2 型糖尿病[6]、溃疡性结肠炎[7]、克罗恩病[8]、鼻咽癌[9]、高血压[10]、慢性肾脏病[11]、哮喘[12]等。肠道菌群可以影响HBV 感染状态。Chou等[13]研究发现，运用抗生素清洁肠道可以显著延长小鼠HBsAg 清除时间、降低HBV DNA 清除率，从而使HBV 转为持续感染状态。Zhu 等[14]亦发现，一过性和急性HBV感染小鼠肠道菌群随HBV感染状态变化而改变，这可能与肠道菌群参与宿主介导HBV 特异性免疫应答有关。关于肠道菌群对持续OBI的影响报道尚不多见。本研究基于课题组前期建立的树鼩持续OBI动物模型，通过比较树鼩肠道菌群改变，拟从肠道菌群角度探讨OBI机制。

1 材料与方法

1.1 持续OBI 树鼩模型的建立 经患者知情同意和医学伦理委员会批准后，采慢性乙型肝炎患者血清作为感染源，分装后置于-80 ℃冰箱中保存。此感染源HBV血清学标志物HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+），HBV-DNA为7.53×108IU/mL，HBV为C基因型。

新生树鼩分别于出生的第1、第3天经双股内侧皮下接种300 μL HBV 病毒液，对照组不作任何处理。分别于树鼩出生后第8、第10、第12、第16、第20、第24、第48、第72 周，经股静脉采血1.5 mL，常规分离后保存于-80 ℃冰箱中。所有动物均饲养于（20±2）℃、湿度40%～60%清洁环境。所有操作均符合广西医科大学动物伦理委员会标准，动物使用许可证号：SYXK-桂2020-0004。

1.2 树鼩血清HBV标志物、HBV DNA拷贝数动态检测 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测树鼩血清HBsAg、HBsAb、HBcAb，实时荧光定量PCR（qPCR）TaqMan 探针法检测树鼩血清HBV DNA。HBsAg、HBsAb、HBcAb 检测试剂盒均购自上海科华生物工程股份有限公司，HBV DNA 检测试剂盒购自中山达安生物技术有限公司。PCR 仪（Light-Cycler480 型Ⅱ）购自瑞士Roche公司。

1.3 树鼩粪便收集和16S rDNA V3+V4区高通量测序 所有树鼩一般状态良好，排除稀便、黑便、尿液或毛发污染等不合格粪便样本，收集合格标本，取少许常温保存行大便潜血实验进一步质控，剩余部分液氮速冻后迅速转移至-80 ℃冰箱中保存。采用胶体金法对18例粪便行大便潜血实验，结果均为阴性，无消化系统疾病，标本合格，可用于后续实验。提取粪便总DNA，采用带Barcode 接头特异性引物对16S rDNA V3+V4区进行PCR扩增，产物纯化、扩增子接头、构建DNA文库，Illumina平台PE250上机双端测序。肠道菌群特异性引物序列：341F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’。

1.4 数据处理和生物信息学分析 采用FASTP（版本0.18.0）软件过滤Illumina 低质量测序数据，FLASH（版本1.2.11)软件读取、拼接原始数据，USEARCH（版本7.1）软件UCHIME 算法去除嵌合体、UPARSE 算法以OTU 相似性＞97%进行聚类（operational taxonomic units,OTU）。OTU 注释在SILVA SSU rRNA 数据库(http://www.arb-silva.de)中进行。通过QIIME（版本v.1.30.1)软件中Mothur 算法计算基于OTUs水平α多样性、β多样性等相关指标。

1.5 统计学方法 对于肠道菌群分析，采用主坐标分析（PCoA）、非度量多维标度分析（MNDS)计算样本间距离，使用非参数Wilcoxon 秩和检验分析α 多样性、β 多样性，Anosim 检验比较分组信息。同时，采用非参数Kruskal-Wallis秩和检验、Wilcoxon秩和检验、线性判别分析（LDA＞2）标准进行LEfSe在线分析（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 树鼩血清HBsAg、HBsAb、HBcAb 和HBV DNA载量检测结果 在8～72周的观察期内，根据血清HBsAg、HBsAb、HBcAb 和HBV DNA 动态结果共有21 只树鼩符合持续性OBI 标准[1]。考虑年龄、性别因素，筛选10 只树鼩作为OBI 组（n=10），8只未经干预树鼩作为正常对照（NC组，n=8）。两组树鼩雌雄各半、年龄相近。

OBI组树鼩血清HBsAg均为阴性，HBcAb多呈阳性（9/10），呈血清抗体阳性型；HBsAb（-）伴HBcAb（-）仅1 只，呈血清抗体阴性型。OBI 组树鼩HBV DNA 载量呈间歇性低水平波动状态，大多低于200 IU/mL，少数HBV DNA＞200 IU/mL。在观察期内，有4 只树鼩（分别为y59-4、271-1、y61-1 和y61-3 号树鼩）血清HBV DNA 自发升高10 倍以上，伴HBsAg（-）/HBsAg（+）血清学转换，其中y59-4 号树鼩血清HBV DNA 较长时间保持在相对高水平（与基线水平相比，14～24 周），另外3 只树鼩随血清HBsAb 出现，HBsAg 很快恢复阴性，血清HBV DNA 也降至基线水平，见图1。观察期内，NC 组树鼩血清均未检测出HBsAg、HBsAb、HBcAb和HBVDNA。

图1 持续OBI树鼩血清HBV DNA拷贝数动态变化

2.2 持续OBI对树鼩肠道菌群OTUs影响 双端测序后OBI 组共得到1 073 881 对原始序列，NC 组共得到871 666 对原始序列，经质量控制后，OBI 组和NC 组分别得到789 098、622 737 对有效测序序列，有效率为73.48%和71.44%。将有效序列进行OTU聚类，OBI 组和NC 组平均每个样本分别得到1 320和1 299 OTU，两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。基于OTU的生物多样性稀释曲线显示可检出的OUT数随测序深度增加已达平台期，表明此次测序深度足以覆盖大多数物种。相对丰度曲线表明，OBI 组物种丰富度高于NC 组，OBI 组样本间物种均匀度优于NC组，见图2。

图2 持续OBI对树鼩肠道菌群OTUs影响

2.3 持续OBI 对树鼩肠道菌群α 多样性影响 采用Chao1 指数、Ace 指数、Sobs 指数、Shannon 指数、Simpson 指数、PD 指数等指标反映肠道菌群α 多样性。两组树鼩肠道菌群Chao1指数、Sobs指数、Ace指数、Shannon 指数和Simpson 指数比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；在系统进化角度，两组树鼩肠道菌群PD 指数比较，差异亦无统计学意义（P＞0.05），表明持续OBI对树鼩肠道菌群α多样性无显著影响。

2.4 持续OBI 对树鼩肠道菌群β 多样性影响 采用PCoA、MNDS 等方法来分析不同样本组内和组间的菌群差异，探讨持续OBI 对树鼩肠道菌群β 多样性影响。PCoA结果显示，PCo1和PCo2两种主坐标贡献率分别为11.73%、10.54%，OBI组和NC组树鼩粪便菌群在进化距离上区分明显（图3A）；NMDS结果显示stress 值为0.085，表明模型相似性高(图3B)。在OUT 水平，分别采用Wilcoxon 检验和Anosim检验计算OBI组和NC组树鼩肠道内菌群在组内和组间进化距离，分析组间距离与组内距离差异性。结果显示，OBI 组和NC 组树鼩肠道菌群组内距离无明显差异（P＞0.05），组间距离差异明显（P＜0.01），表明OBI 组和NC 组树鼩肠道菌群的组间差异大于组内差异，持续OBI可以降低树鼩肠道菌群β多样性，见图3C、图3D。

图3 持续OBI对树鼩肠道菌群β多样性影响

2.5 持续OBI 对树鼩肠道粪便样本物种组成差异性影响 为了进一步探讨持续OBI 对树鼩肠道菌群物种组成的影响，本研究从门、纲、目、属等分类学水平分别对树鼩肠道内前10 优势物种进行差异性分析。结果发现，在门水平，树鼩肠道菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、Epsilonbacteraeota、蓝藻门（Cyanobacteria）等组成，其相对丰度在OBI组和NC组树鼩肠道菌群占比分别为99.72%、99.84%。其中，OBI 组树鼩肠道内厚壁菌门的相对丰度（%）显著高于NC组（P＜0.05），拟杆菌门在OBI 组和NC 组相对丰度（%）无显著差异（P＞0.05）。与NC 组相比，OBI 组树鼩厚壁菌门/拟杆菌门比值（F/B）无明显差异(P＞0.05）。在纲水平，持续OBI主要影响树鼩肠道梭状芽孢杆菌（Clostridia），其在OBI 组树鼩肠道相对丰度显著高于NC 组（P＜0.01）；在目水平，持续OBI 主要影响树鼩肠道梭状芽孢杆菌（Clostridiales），OBI 组树鼩肠道梭状芽孢杆菌目相对丰度显著高于NC组（P＜0.01）；在属水平，OBI组树鼩肠道大肠埃希―志贺菌（Escherichia-Shigella）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）均显著低于NC 组（均P＜0.05），见图4。

图4 不同分类学水平树鼩肠道内前10优势物种组成差异性分析

2.6 LEfSe法分析持续OBI对树鼩肠道菌群影响 OBI 组和NC 组差异性菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门组成。OBI组树鼩肠道厚壁菌门主要包括梭菌纲（Clostridia，LDA=3.75，P=0.001）、梭菌目（Clostridiales，LDA=3.72，P=0.0059）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae，LDA=3.42，P=0.016）、毛螺菌属（Lachnoclostridium，LDA=2.74，P=0.0076）；NC组则主要由气球菌科（Aerococcaceae，LDA=2.47，P=0.033）、气球菌属（Aerococcus，LDA=2.86，P=0.0019）、气球菌种（Aerococcus_urinaeequi，LDA=2.25，P=0.015）、Lactobacillus_ruminis（LDA=3.01，P=0.0032）组成。在拟杆菌门方面，OBI 组树鼩肠道菌群主要包括脆弱拟杆菌（Bacteroides_fragilis，LDA=3.07，P=0.037）、普氏菌属7（Prevotella_7，LDA=3.27，P=0.00042）、Muribaculaceae（LDA=2.58，P=0.041）；NC 组树鼩肠道则由Myroides（LDA=2.82，P=0.00058）、Myroides_odoratimimus（LDA=3.02，P=0.00035）、Bacteroides_coprophilus_DSM_18228_JCM_13818（LDA=3.37，P=0.016）等组成。在变形菌门方面，OBI组树鼩肠道菌群主要由Succinivibrionaceae（LDA=2.42,P=0.034）、Snodgrassella（LDA=2.13，P=0.024）、Snodgrassella_alvi（LDA=2.13,P=0.024）、克雷伯菌属（Klebsiella，LDA=3.00，P=0.033）组成；NC 组树鼩肠道菌群则由Vibrionales（LDA=2.50，P=0.0049）、Vibrionaceae（LDA=2.50,P=0.0050）、Moraxellaceae（LDA=2.59，P=0.0077）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter，LDA=2.51,P=0.012）、大肠埃希―志贺菌属（Escherichia-Shigella，LDA=4.21，P=0.021）组成，见图5。这些差异菌群均可能成为持续OBI潜在的生物标志物。

图5 树鼩肠道内前50种主要物种LEfSE分析

3 讨论

OBI由于其特殊性，感染者不易被发现，多进展为肝硬化、肝癌等终末期。目前普遍认为，OBI是隐源性肝癌的主要病因，整体临床预后比HBV/HCV相关性肝癌更差[15]。在慢性丙型肝炎、酒精性肝硬化、非酒精性脂肪肝病等疾病中，OBI是其独立危险因素，可以显著增加肝癌的发病率[16-17]。OBI还与肝移植、输血安全、血液透析等密切相关[16]。Candotti等[18]追踪了3 例血清HBsAg 阴性、HBV＜20 IU/mL多次献血OBI感染者，在31位受血者中，9位受血者确诊感染HBV，这严重影响输血安全。因此，探讨OBI机制，清除HBV DNA显得尤为重要。

本研究中，通过给新生树鼩皮下注射106～107IU/mL HBV DNA 病毒液，使树鼩血清HBsAg（-）/HBV DNA（+），成功构建了树鼩持续OBI 动物模型。在持续OBI树鼩中，HBV血清标志物的表达模式呈多样性，以HBcAb(+)最为多见；血清HBV DNA 呈间歇性低水平波动状态，大多低于200 IU/mL，这与樊璐[19]、周怡等[20]、Wu 等[21]等报道结果一致，符合OBI 的表现形式。此外，在OBI 树鼩中，乙肝表面标志物表达形式和血清HBV DNA水平并非一成不变。在OBI 组树鼩中，有4 只（分别为y59-4号、271-1 号、y61-1 号和y61-3 号）树鼩血清HBV DNA 自发性升高10 倍以上，伴HBsAg（-）/HBsAg（+）血清学转换，表现为HBV再激活，这为临床OBI患者敲响警钟，尤其是即将或正在接受免疫抑制治疗患者[22]。值得注意的是，即使特异性HBV 表面标志物均未检出，但血清仍可持续检出低滴度HBV DNA（277-4 号树鼩），这为减少HBV 感染漏诊、传播和预防OBI再激活等提出了新的挑战。

由于肝脏70%血液是由门静脉供应，肠源性毒素、肠道菌群移位、微生物代谢产物等会不断进入肝脏，进而调节肝脏特异性免疫应答，影响HBV 感染状态，HBV感染亦可影响肠道微生物群落的多样性和组成。Zhu等[14]观察5～7周龄一过性HBV感染和持续HBV 感染小鼠肠道菌群动态变化，发现HBV感染可以延缓小鼠肠道菌群发育，影响其多样性。Yun等[23]研究发现，在HBsAg阳性的HBV携带者中，ALT 升高的患者肠道菌群多样性显著低于ALT正常的携带者，表明肠道菌群多样性可能与肝功能损害程度有关。本研究中，持续OBI可以显著降低树鼩肠道菌群β 多样性，这可能是由于树鼩出生即接种HBV 致使肠道内某些细菌无法生长和定植，这还需要进一步研究。厚壁菌门大多为革兰氏阳性菌，可以吸收、消耗大量能量，其被认为与肥胖、脂代谢、胰岛素抵抗有关[24-25]。本研究中，OBI组树鼩肠道内厚壁菌门相对丰度显著高于NC组（P＜0.05)，表明HBV介导特异性免疫应答需要增加能量消耗，肠道菌群可能通过增加能量消耗促进HBV特异性免疫应答[26]。梭状芽孢杆菌（Clostridia）是胃肠道中最常见的革兰阳性菌之一。Atarashi 等[27]研究发现，梭状芽孢杆菌能促进小鼠表达TGF-β、IL-10，抑 制TNF-α、IL-17 表达，从而促 进CD4+、FOXP3+Treg 细胞增殖和分化，促进Treg 细胞的归巢，其机制可能与梭状芽胞杆菌XIVa、IV、XVIII 决定簇和产生丁酸盐、异丁酸盐等短链脂肪酸有关。短链脂肪酸（SCFAs）在维持健康方面具有多种功能，如增强上皮屏障功能，降低炎症水平，促进外周血Treg细胞的生成等[28]。丁酸盐是短链脂肪酸的一种，是肠道黏膜细胞的主要能量来源，可以激活抗炎因子TGF-β、IL-10，抑制组蛋白脱乙酰基酶的活性，下调NF-κβ 介导的炎症反应[29]，在本研究中，持续OBI 树鼩肠道中产生丁酸盐的梭状芽胞杆菌（Clostridia）相对丰度显著高于NC 组，表明其可能通过上述途径参与HBV介导的免疫应答。此外，胆汁酸是微生物的重要调节因子，胆汁酸的异常会导致微生态失调。在本研究中，OBI 组树鼩肠道内产生次级胆汁酸的梭状芽孢杆菌（Clostridiales）显著高于NC 组（P＜0.05)，表明持续OBI 可以通过改变肠道菌群组成影响胆汁酸的代谢。

本研究基于前期实验室成功构建的树鼩持续OBI 动物模型，比较了持续OBI 树鼩和正常树鼩肠道内微生物差异，这为进一步研究OBI潜在的免疫学机制、减少HBV传播、预防HBV再激活等提供了新思路。