纳米银线柔性导电薄膜的抗菌性分析及毒性评估 *

徐家星，张俊武，马红艳

(天津科技大学 化工与材料学院学院，天津 300457)

0 引 言

柔性导电薄膜，是既具备良好的柔韧性，又具有优异的导电性的复合光电材料[1]。根据其材料组成的不同，导电薄膜可以分为氧化物薄膜[2]、有机高分子导电薄膜[3]、金属导电薄膜[4]和纳米金属线导电薄膜[5]。在导电柔性材料研究的早期，导电薄膜所采用的材料主要是氧化铟锡(ITO)，但是，此种材料成本较高，原料稀缺且柔韧性较差的特点限制了它在柔性导电材料方向的应用和发展[6]。和氧化铟锡制备的柔性导电薄膜相比，纳米银线制备的柔性导电薄膜在导电性和透明度等方面都展现了相似甚至更优的性能。纳米银导电薄膜的制备技术日益成熟，使用前景越来越广泛。Akter等[7]通过使用表面活性物质来改善柔性薄膜衬底的亲水性，调节表面张力，制备出了均匀性较好、导电性优良且透光率高的柔性导电薄膜。Lin等[8]将石墨烯和纳米银线溶液混合作为喷涂溶液，制备出了方阻300 Ω/sq，透光率高于80%的柔性导电薄膜。Guo等[9]通过低速度的旋涂法制备出了均匀性和导电性优异的导电薄膜，其透光率在95%以上，方阻大幅降低到20 Ω/sq以下，展现出比传统材料氧化铟锡更为优异的性能。因为其越来越优异的亲水性，柔韧性和导电性，柔性导电薄膜材料在医学领域的应用逐步拓展。鉴于生物医学领域的特殊性，所使用的材料的生物安全性能是不容忽视的研究目标。目前，对于柔性导电材料生物安全性的研究，处于起步阶段，鲜有系统性的研究与报道。

银的抗菌作用和机制已被人类使用和研究了数千年。普遍认为，当带正电的银离子与致病菌细胞膜接触时会产生吸附作用，随后会攻击细胞膜的磷脂双分子层，最终导致细胞破裂死亡[10]。纳米银与银离子有着不同的抗菌机理与效果，施庆珊[11]等人的研究发现，银离子比纳米银粒子有更强的抗菌活性。由于其结构的特殊性，纳米银线的抗菌性能也不同于纳米银颗粒。因此，用其制成的柔性导电薄膜，用于医疗领域时，其表现出的抗菌性能目前尚不明确，国内外有很多研究关注于纳米银线柔性导电薄膜的导电性、柔韧性和透光性[12-15]，但是对于其抗菌性能的研究却鲜有报道。随着其应用从传统的太阳能，触控屏，显示屏等领域[16-19]，逐渐扩展到材料医学等与人体相关的领域[20-21]，探究其对常见致病菌的抗菌效果尤为重要。

除了抗菌性的研究，在医疗领域，纳米银柔性导电膜的生物安全性也越来越引起关注。研究表明，高浓度的纳米银也对人体产生一定的风险。张紫虹[22]等人使用纳米银复合醋酸氯已定消毒凝胶进行动物皮肤刺激试验，结果表明其样品未产生刺激性。陈炯[23]等将纳米银敷料应用于Ⅱ度临床烧伤患者。研究结果显示，此敷料未在患者体内产生银沉积，使用样品在银代谢安全范围内。

本研究采用多元醇还原法，通过优化温度，反应时间等因素，使用二水合氯化铜作为稳定剂，制备出了长度在5～10 μm左右，长径比为50～100左右的AgNWs。进而采用喷涂法，通过使用自制凹槽模具，制备了银线铺展均匀的AgNWs/PDMS柔性导电薄膜。最后，探究了AgNWs/PDMS柔性导电薄膜对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等几种常见致病菌的的抗菌效果，并通过柔性薄膜在生理盐水中银含量的释放规律的定量分析以及其对人成纤维细胞细胞形态的影响，进一步评估了其可能造成的细胞毒性风险大小。

1 实验材料及方法

1.1 主要试剂材料

无水乙醇(分析纯)，天津市汇杭化工科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(pvpK29-32)，上海晶纯生化科技股份有限公司；硝酸银(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；二水合氯化铜(分析纯)，上海晶纯生化科技股份有限公司；PDMS，东烷市艺辉胶粘剂有限公司；乙二醇(分析纯)，天津百伦斯生物技术有限公司；胰蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；Invitrogen SYTO9 染色剂，上海恒斐生物科技有限公司；胎牛血清，上海江林生物科技有限公司；青霉素链霉素溶液，北京百奥莱博科技有限公司；DMEM培养基，上海联硕生物科技有限公司。

1.2 主要实验仪器

WPL-65BE型电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；YA28X-4T/10Ⅱ型高压蒸汽灭菌锅，宁波永兴医疗器械公司；JSM-6380 LV型扫描电子显微镜，日本电子株式会社，样品喷金处理，扫描电压20 kV，放大倍数2000倍、5000倍；TGL-16M型台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；ZNCL-TS50ML型智能磁力搅拌器，天津科诺仪器设备有限公司；UCS-650型超声波细胞破碎仪，杭州米欧仪器有限公司，调节频率40 kHz，工作周期45s，间隔时间5s；ICAPQ型电感耦合等离子体发射光谱仪，德国赛默飞世尔，；HNY-200B型恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司；AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；FE28型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；101-0AB型电热鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司； BioTek Cytation 1细胞成像多功能检测系统，北京安麦格贸易有限公司。

1.3 AgNWs的制备

取纯乙二醇作为稀释剂，分别配置5 mM CuCl2溶液、0.15 M聚乙烯吡咯烷酮(pvpK29-32)溶液和0.1 M AgNO3溶液。然后，将10 mL纯乙二醇加入50 mL圆底烧瓶中，放入智能磁力搅拌器。调节智能磁力搅拌器温度为150 ℃，转速为260 rpm，反应1 h后，加入100 μl的CuCl2溶液，再过20 min，缓慢加入3 mL pvpK29-32溶液和3 mL AgNO3溶液，随后再加热1h，室温下冷却30 min，最后用50 mL的乙醇和去离子水在2000 rpm，20 min的条件下分别离心洗涤两次，将纯化后的纳米银线(AgNWs)乙醇溶液放于4 ℃冰箱内保藏。

1.4 AgNWs/PDMS柔性透明导电薄膜的制备

将分散、调配好的AgNWs乙醇溶液装入喷枪，调节喷枪喷头高度为40 mm、喷头气压控制在10 kPa。同时在基底材料(聚四氟乙烯，凹槽尺寸4×4 cm2，凹槽深度1 mm)表面粘附涂易乐FS-204表面活性剂来改善基底材料的亲水性。然后采用喷涂法将配置的AgNWs乙醇溶液均匀喷涂在洁净的基底上。喷涂结束后，将材料放入150 ℃处理30 min，随后将PDMS的A液与B液按10:1的比例混匀，填入凹槽，去除多余试剂，150 ℃处理30 min，得到AgNWs/PDMS柔性透明导电薄膜，实验流程如图1所示。

图1 柔性导电薄膜制备流程图Fig 1 Fabrication process of flexible conductive film

1.5 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜抗菌性实验

将AgNWs含量分别为0、0.12、0.24、0.36 mg/cm2的AgNWs/PDMS薄膜用打孔器分别打成直径为6mm的圆片，并在紫外灯下灭菌5h，每隔30 min翻面一次，使薄膜表面充分杀菌。将大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、铜绿假单胞菌(PAO1)菌液活化，并分别取200 uL对数生长期菌液，用LB培养基在24孔板中分别梯度稀释105倍，将薄膜圆片放入培养液中，在37 ℃，160 rpm条件下培养24 h。然后将膜圆片用灭菌处理后的镊子轻轻取出，用PBS涮洗3次后，将膜圆片放入50 mL的离心管中，加入10 mL的 PBS缓冲液，在超声破碎仪中，以40 kHz的频率，超声40 s，间隔时间为5 s。最后将超声后菌液进行梯度稀释，并最终选取2.5 μL，稀释倍数为 103倍的稀释液在相应的平板上点样进行菌落个数的测定。

1.6 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜在生理盐水中累积银含量的测定

将AgNWs含量分别为0.12、0.24和0.36 mg/cm2，直径为6 mm的薄膜圆片各5个，UV灭菌处理后，分别浸泡于10 mL生理盐水中，在1、5、10、20、30天时分别取浸泡液，用德国赛默飞世尔ICAPQ型电感耦合等离子体发射光谱仪测定浸泡液中银的含量。

1.7 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜对人真皮成纤维细胞形态影响实验

将灭菌处理过的AgNWs含量为0.12、0.24和0.36 mg/cm2，直径为6 mm的薄膜圆片与接种量106个细胞/孔的人真皮成纤维细胞置于TCPS板中，留出一个不加材料的作为空白对照，加入添加了10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素链霉素(PS)的改良的DMEM培养基100 μL，在37 ℃恒温培养箱共培养48 h后，用Invitrogen SYTO9 染色剂染色，并用Cytation1 多功能荧光成像检测系统观察。

1.8 图像和统计学分析

利用软件ImageJ(V1.8.0)对AgNWs与AgNWs/PDMS电镜图片进行物理结构观察和分析；利用软件SPSS(IBM, V. 24)对AgNWs/PDMS柔性导电薄膜抗菌实验数据以及在生理盐水中扩散的银含量的数据进行单向方差分析，进而探讨其抗菌性能及其细胞毒性。

2 结果与分析

2.1 AgNWs及AgNWs/PDMS柔性导电薄膜微观结构观察与分析

使用日本JSM 6380 LV扫描电子显微镜SEM分别表征AgNWs以及AgNWs/PDMS薄膜的微观结构，其结构如图2所示。进而通过ImageJ(V1.8.0)对图像进行分析发现，银线长度大部分在5～10 μm左右，长径比在50～100左右，银颗粒含量较少，没有聚集成团的现象。此结果表明，本研究使用的制备方法可以有效促进银线形成多重栾晶，减少银线颗粒的形成，并促进栾晶向银线方向的延长，增加银线的生长长度。AgNWs/PDMS薄膜电镜表征显示，PDMS层与AgNWs层的分界较为明显，银线铺展均匀，银颗粒含量较少，AgNWs层厚度在10μm左右，AgNWs层表面较为粗糙，PDMS层质地均匀，杂质含量较少。表明本研究所采用的借助凹槽模具的方法可以有效控制薄膜的物理结构，控制银线层涂覆的均匀性。

图2 银纳米线的电镜图(a)与柔性导电薄膜电镜图(b)Fig 2 SEM images of AgNWs and SEM images of AgNWs/PDMS film

2.2 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜抗菌性能

图3是不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS柔性导电薄膜对三种致病菌E.coli，S.Aureus和PAO1抗菌率的比较。经SPSS(IBM, V. 24)使用单向方差分析，不含AgNWs的PDMS薄膜和含AgNWs的AgNWs/PDMS薄膜上的E.coli、S.aureus、PAO1的菌落数差异显著(p<0.05)。相比不含AgNWs的PDMS膜，当AgNWs/PDMS 膜的AgNWs含量达到0.36 mg/cm2时，E.coli菌落数减少了13倍左右，PAO1菌落数减少了21倍左右，S.aureus菌落数减少了42倍左右。与不含AgNWs的PDMS膜相比，随着AgNWs含量的逐步增加，AgNWs含量为0.12、0.24和0.36 mg/cm2的AgNWs/PDMS薄膜上粘附的三种致病菌的菌落数逐渐减少，与对照组的差异显著性也逐渐增加。

图3 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜单位面积菌落个数Fig 3 AgNWs/PDMS flexible conductive film number of colonies per unit area

2.3 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜中银的释放规律

图4是经过30天的浸泡，AgNWs/PDMS柔性导电薄膜在生理盐水中释放的累积银浓度。结果表明，不含AgNWs的PDMS薄膜以及不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS薄膜之间，在生理盐水中释放的银含量差异显著(p<0.05)。其中0.36mg/cm2AgNWs含量的薄膜圆片比0.12 mg/cm2AgNWs的银含量高3倍以上(p<0.01)，差别显著。同时发现，AgNWs/PDMS薄膜中银的释放，在起始的1-2天呈现出大量的释放量，后面的时间内一直呈现稳定的少量累积释放。这个结果表明，银的释放符合突释规律，其突释期累积释放率在80%以上。这个结果表明，通过样品的预先浸泡处理，可降低因为银释放而可能诱发的细胞毒性。

图4 柔性导电薄膜在生理盐水中银含量释放规律图Fig 4 The silver content release pattern of flexible conductive film in normal saline

表1是经过30天浸泡，AgNWs/PDMS柔性导电薄膜最终释放的银含量占薄膜总银量的比例。结果表明，薄膜圆片在生理盐水中银含量不仅随着浸泡时间的延续逐渐增加，并且随着薄膜中AgNWs含量的增加而提高，最终稳定在薄膜本身银含量的10%左右。

表1 最终生理盐水中的含银量占薄膜含银量的比例

2.4 AgNWs/PDMS柔性导电薄膜的毒性评估

表2是浸泡在生理盐水30天后，不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS薄膜在生理盐水中最终稳定的银浓度。根据熊玲等[24]和熊旭华[25]的纳米银的毒性评估标准，当纳米银粒径在100 nm以下，银浓度在一定范围内(2.5～25)μg/mL时，呈现轻微细胞毒性(0～1)级，毒性大小与含量呈量效关系，并随着浓度增加而增加。当大于50 μg/mL时，显示出明显的细胞毒性，量-效相关性也随之消失，粒径较小的微米银(0.50～1.67 μm)在银浓度达到250 μg/mL时显示明显的细胞毒性，粒径较大的微米银粒子(1.43～7.14 μm, 1.74～45 μm)在所有试验浓度下未显示细胞毒性，且同粒径的纳米银线毒性弱于纳米颗粒。本研究所制备纳米银线直径在100 nm左右，结合表2得出结论，0.36 mg/cm2AgNWs含量的薄膜会产生轻微的细胞毒性(0～1)级，0.12 mg/cm2、0.24 mg/cm2AgNWs含量的薄膜不会产生细胞毒性。

表2 生理盐水中最终的含银量

进一步通过人真皮成纤维细胞与3个不同浓度的AgNWs/PDMS导电薄膜圆片共培养，48 h 染色后观察细胞形态观察，结果如图5所示。与对照相比，和3种薄膜圆片共培养的人真皮成纤维细胞均形态正常贴壁，并未造成明显的细胞死亡现象，说明短期时间内银的积累均未造成明显的细胞毒性。3种薄膜材料的生物安全性，可以满足其用于人皮肤表面相关医疗材料的用途.

图5 人成纤维细胞形态 (a)TCPs对照(b)AgNWs 0.12mg/cm2(c)AgNWs 0.24 mg/cm2(d)AgNWs 0.36 mg/cm2 比例尺：50μmFig 5 Human fibroblast morphology: (a) TCPs contrast; (b) AgNWs 0.12; (c) AgNWs 0.24; (d) AgNWs 0.36. scale bar: 50 μm

3 结论

研究通过多元醇还原法制备了长度在5～10 μm，长径比在50～100的AgNWs，并利用聚四氟乙烯凹槽模具，采用喷涂法制备了AgNWs含量分别为0.12、0.24、0.36 mg/cm2的AgNWs/PDMS薄膜并对其进行了抗菌性实验、30天银含量释放测定实验以及细胞毒性试验，得到如下结论：

(1)含AgNWs的AgNWs/PDMS薄膜对E.coli、S.aureus、PAO1几种常见致病菌具有显著的抗菌性能，并随着AgNWs含量的增加而提升。

(2)3种不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS薄膜对人真皮成纤维细胞形态不会造成明显影响，也并未造成明显的细胞死亡现象。

(3)薄膜在生理盐水中的银含量释放符合突释规律，其起始的1-2天累积释放率在80%以上，累积银浓度在不产生细胞毒性的(0～1)级安全范围内，可以满足其用于人皮肤表面相关医疗材料的用途。