茄子1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因的生物信息学及其响应逆境胁迫的表达分析

万发香，王连臻，高军

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003）

乙烯是一种重要的植物激素，在植物花的发育[1-2]、果实的成熟[3-5]、遭受机械损伤[6-7]和生物与非生物胁迫[8-10]等过程中具有重要的调控作用。而1-氨基环丙烷-1- 羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）合成酶（ACC synthase,ACS）是植物体内调节乙烯形成的关键酶和限速酶。ACC 合成酶（ACS）是以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate,PLP）为辅酶的酶家族，在高等植物中由多基因家族编码[11]。已在多种植物中发现了编码ACC 合成酶的ACS基因，其中：拟南芥中存在12 个ACS基因[12]，番茄中至少存在9 个[7]，水稻中存在5个[11,13]，西葫芦中至少有2个[11]，枇杷中至少有2个[14]等；并且在牵牛花[2]、猕猴桃[15]、香蕉[16]、西瓜[17]、葡萄[18]、桃[3]、番木瓜[19]、荔枝[20]、李[21]、甘蔗[22-24]、茶树[25]和树莓[26]等作物中也有ACS基因的相关研究报道。

茄子是生长在热带和温带地区的一种重要的蔬菜作物，而目前关于茄子中与乙烯生物合成相关的ACS基因的研究报道相对较少。因此，基于本课题组前期得到的茄子低温转录组数据，筛选到1 个显著差异表达基因，并根据该基因编码的氨基酸序列，经NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blastp比对，发现其属于编码ACC合成酶的基因ACS。在此基础上，对其进行系统的生物信息学分析，同时，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）探究其在低温、高温、干旱和盐胁迫处理不同时间后的表达情况，从而为进一步探索与逆境胁迫相关的茄子ACS基因（SmACS）的生物学功能研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

使用MEGA X 软件，通过最大似然法（maximum likelihood,ML）构建基于茄子SmACS与拟南芥、番茄和烟草等10个物种同源蛋白的系统进化树；利用Jalview 软件对10 个物种同源蛋白多重序列进行比对分析；使用在线工具MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）分析SmACS 蛋白的保守基序；使用TBtools 软件分析SmACS基因的结构[27]；利用在线工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析SmACS基因转录起始位点ATG上游2 000 bp启动子区的顺式作用元件；利用在线工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析茄子SmACS 蛋白的理化性质；利用在线工具SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测茄子SmACS蛋白的信号肽；利用在线工具TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测茄子SmACS 蛋白的跨膜结构域；使用在线工具CELLO 2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）对茄子SmACS蛋白进行定位预测；利用在线网站HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）分析SmACS的功能结构域；利用在线软件NetPhos 3.1 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测SmACS 蛋白的磷酸化位点；使用在线工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测SmACS 蛋白的二级结构；使用在线分析工具Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）预测SmACS 蛋白的三级结构；利用在线分析软件STRING（https://string-db.org/）预测SmACS 蛋白的互作网络。

1.2 茄子SmACS 基因响应逆境胁迫时的表达特性分析

以温室（27 ℃条件下光照处理16 h/19 ℃条件下黑暗处理8 h）中盆栽生长60 d左右且大小一致的三月茄为实验材料，分别对其进行低温（4 ℃）、高温（40 ℃）、干旱和盐（200 mmol/L NaCl）胁迫处理，以未进行任何胁迫处理的叶片组织为对照组。在低温和高温胁迫组分别处理1、3、6、12和24 h，干旱胁迫组处理3、6 和12 h，盐胁迫组处理6 h 后，摘取各处理叶片，迅速用液氮冷冻，之后置于－80 ℃冰箱中保存，备用。参照植物RNA 提取试剂盒（HiPure HP Plant RNA Kit）说明书，提取经低温、高温、干旱和盐胁迫处理不同时间后的三月茄叶片RNA；利用莫纳生物反转录酶试剂盒（MonScriptTMRTⅢAll-in-One Mix with dsDNase）反转录不同处理样品的RNA，得到cDNA；将反转录得到的cDNA稀释一定倍数，作为qRT-PCR的模板。以腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyl transferase,APRT）为内参基因并设计其引物；以SmACS-F、SmACS-R引物来检测SmACS基因在不同逆境胁迫下的表达水平。引物序列见表1，委托北京擎科生物科技有限公司合成。在罗氏Cobaz480 实时荧光定量PCR 仪上进行qRT-PCR试验，每个样品设置3个生物学重复，采用2－△△CT法进行相对表达量的分析。

2 结果与分析

2.1 茄子SmACS蛋白的同源性比对与分析

基于本课题组前期得到的茄子高通量转录组数据，筛选到1 个低温胁迫后显著差异表达的基因SmACS。根据该基因编码的蛋白质序列，利用NCBI数据库的Blast搜索功能，发现该蛋白与1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACC）的同源性最高。同时，筛选出20个与该蛋白同源性较高物种的蛋白质序列，运用MEGA X 软件的最大似然法构建系统发育进化树。结果表明，SmACS 蛋白与大豆的相似性最高，为69.98%；与同属茄科的番茄ACS 的同源性为69.65%；与拟南芥、烟草和番茄等10 个物种的相似性均在52%以上（图1），说明该基因在生物进化过程中相对保守。进一步对SmACS蛋白进行多重比对发现，11个物种的ACS同工酶均含有7个保守结构域，并含有转氨酶中保守的氨基酸，且含有与底物特异性有关的保守谷氨酸残基（图2）。这说明茄子SmACS 蛋白具有高度保守的结构域和转氨酶位点。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.2 茄子SmACS 蛋白的保守基序（motif）及其基因结构分析

图1 茄子SmACS蛋白的氨基酸序列与其他物种同源序列的系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of SmACS protein from eggplant and homologous sequences from other species

图2 茄子SmACS蛋白与其他物种ACS蛋白序列多重比对结果Fig.2 Results of multiple alignment among SmACS protein from eggplant and ACS proteins from other species

为更好地了解SmACS基因的功能，对茄子SmACS 蛋白的保守基序、结构域及其基因内含子-外显子结构进行分析。结果发现，茄子SmACS 蛋白含有10种保守基序（基序1～基序10），每种保守基序各有2个，且SmACS蛋白的最左侧为基序2，最右侧为基序8（图3）。同时，分析SmACS基因的结构发现，该基因位于第8 号染色体上，基因全长3 550 bp，编码序列长1 437 bp，含有3个内含子和4个外显子，属典型的ACS基因结构（图4）。

图3 茄子SmACS蛋白的保守基序分析Fig.3 Conserved motif analysis of SmACS protein from eggplant

图4 茄子SmACS基因结构分析Fig.4 Structure analysis of SmACS gene from eggplant

2.3 茄子SmACS 蛋白的理化性质分析

利用在线工具ProtParam 分析茄子SmACS 蛋白的理化性质。结果表明：SmACS蛋白主要由478个氨基酸组成，具体包括亮氨酸（leucine, Leu）43个，丝氨酸（serine, Ser）和缬氨酸（valine,Val）各33个，苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）32 个，天冬氨酸（aspartic acid,Asp）和赖氨酸（lysine, Lys）各31 个，丙氨酸（alanine,Ala）30 个，甘氨酸（glycine,Gly）和异亮氨酸（isoleucine, Ile）各29 个，天冬酰胺（asparagine,Asn）和谷氨酸（glutamic acid,Glu）各28个，精氨酸（arginine,Arg）25 个，苏氨酸（threonine,Thr）22 个，脯氨酸（proline, Pro）19 个，谷氨酰胺（glutamine,Gln）和甲硫氨酸（methionine,Met）各14个，组氨酸（histidine,His）12 个，半胱氨酸（cysteine,Cys）10 个，酪氨酸（tyrosine, Tyr）9 个和色氨酸（tryptophane,Trp）6 个。其中，亮氨酸（Leu）的含量占比最大（9%），丝氨酸（Ser）和缬氨酸（Val）的含量占比次之（各占6.9%），色氨酸（Trp）的含量占比最小（仅为1.3%）。茄子SmACS 蛋白的分子质量为54.03 kDa，等电点为6.48，带负电荷的Asp和Glu残基总数为59，带正电荷的Arg和Lys残基总数为56；茄子SmACS 蛋白的不稳定系数为41.39，表明该蛋白为不稳定蛋白；脂肪指数为85.04，亲水系数为－0.206，表明该蛋白为亲水性蛋白。进一步分析发现，该蛋白无信号肽，属非分泌性蛋白，且不含跨膜结构，表明其不属于膜蛋白。亚细胞定位预测结果表明，该蛋白主要定位于细胞质中。

2.4 茄子SmACS 蛋白二级和三级结构分析

蛋白质的二级结构主要是指蛋白质的多肽链中有规则重复的构象。通过在线SOPMA软件预测茄子SmACS 蛋白的二级结构，如图5 所示：茄子SmACS蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链；其中，213 个氨基酸构成α-螺旋，所占比例最大（44.56%），158 个氨基酸构成无规则卷曲，占33.05%，70个氨基酸构成延伸链，所占比例为14.64%，而37 个氨基酸构成β-转角，占7.74%。由此可见，茄子SmACS 蛋白的主要构成元件为α-螺旋，其功能主要为连接其他二级结构元件，而无规则卷曲为次要构成元件。

蛋白质三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布，它是建立在二级结构、超二级结构和结构域上的球状蛋白质的高级空间结构。SmACS基因编码的蛋白质三级结构同源建模的参考模板为1iay.1.A，提交的SmACS基因编码的蛋白序列与模板覆盖率为88%，序列一致性为73.87%，推测SmACS编码的蛋白质可能具备与参考模板相同的催化活性。通过Swiss-Model在线程序同源建模，预测SmACS蛋白的三级结构。结果显示，茄子SmACS蛋白的三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成（图6），这与二级结构的预测结果一致。

图5 茄子SmACS蛋白二级结构的预测结果Fig.5 Predicted results of secondary structure of SmACS protein from eggplant

2.5 茄子SmACS蛋白的结构域与磷酸化位点分析

利用在线网站HMMER 分析SmACS 蛋白的保守结构域，结果（图7）显示：SmACS 具有保守的Aminotran_1_2 结构域，与大豆ACS1基因编码的蛋白质的一致性为71.1%，相似性为86.7%，准确性为0.98。通过在线软件NetPhos 3.1 Sever预测SmACS蛋白的磷酸化位点，结果（图8）表明：SmACS 蛋白共存在39 个磷酸化位点，其中包括20 个丝氨酸（Ser）磷酸化位点、16 个苏氨酸（Thr）磷酸化位点和3 个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。由此可见，茄子SmACS 蛋白的磷酸化位点主要以丝氨酸和苏氨酸为主，酪氨酸最少。

图6 茄子SmACS蛋白三级结构的预测结果Fig.6 Predicted result of tertiary structure of SmACS protein from eggplant

图7 茄子SmACS蛋白的保守结构域Fig.7 Conserved domain of SmACS protein from eggplant

2.6 茄子SmACS 蛋白的互作网络分析

由于茄子未被收集在STRING蛋白互作数据库中，通过在线工具STRING将茄子SmACS蛋白与同属茄科作物番茄的ACS1A蛋白进行比对，利用其蛋白互作关系构建互作网络。如图9所示：ACS1A蛋白与4 个ACC 氧化酶（100125909、ACO1、ACO2 和aco5）、1 个S-腺苷甲硫氨酸合酶（101245012）、2 个S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（101260400和101262142）、2 个抗坏血酸依赖性氧化还原酶（101266529 和543506）和1 个未被注释到的蛋白（101265343）互作。推测茄子SmACS 蛋白主要与ACC 氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和抗坏血酸依赖性氧化还原酶发生相互作用。

图8 茄子SmACS蛋白的磷酸化位点Fig.8 Phosphorylation sites of SmACS protein from eggplant

2.7 茄子SmACS 基因的顺式作用元件分析

利用在线工具PlantCARE 对SmACS基因起始密码子上游2 000 bp 的序列进行顺式作用元件分析。结果表明：SmACS基因包含TATA 框（TATAbox）和CACA 框（CACA-box）顺式作用元件，表明SmACS基因能正常进行转录，且SmACS基因启动子区含有脱落酸、乙烯、冷胁迫、水杨酸及伤口响应等有关的元件，其中乙烯响应元件最多，脱落酸和冷胁迫涉及的顺式作用元件相对较多（表2）。表明茄子SmACS基因可能主要参与果实发育、低温胁迫和脱落酸响应的信号转导过程。

图9 ACS1A蛋白的互作网络Fig.9 Interaction network of ACS1A protein

2.8 茄子SmACS基因响应非生物胁迫的表达分析

为了进一步明确茄子SmACS基因的潜在功能，我们通过qRT-PCR 分析其在非生物胁迫处理后的表达情况。在4 ℃条件下处理不同时间时，SmACS基因受诱导表达，尤以4 ℃条件下处理12 h时，其表达量上调幅度最大，约为对照（0 h）的281.8 倍（图10A）。在高温（40 ℃）胁迫下，SmACS基因表达量呈先上升后降低的趋势，其中，在1 和3 h 时表达量分别为对照（0 h）的7.5倍和4.6倍，而在6、12和24 h时，其表达受到抑制（图10B）。在干旱胁迫下时，SmACS基因的表达量在3 h 时上调幅度最大，约为对照（0 h）的32.2倍；在6 h时，其表达量约为对照组的1.3倍；而处理12 h时，其表达受到抑制（图10C）。受盐（NaCl）胁迫6 h时，SmACS基因的表达上调，而该基因受NaCl 胁迫后在不同时间的表达情况还有待于进一步的试验分析（图10D）。由以上结果可知，SmACS基因可受低温、高温、干旱和盐胁迫的诱导而表达，其中低温（4 ℃）处理对SmACS基因表达的上调作用最为显著。

表2 SmACS基因启动子区域主要顺式作用元件Table 2 Main Cis-acting elements in the promoter region of SmACS gene

3 讨论

ACC 合成酶（ACS）是植物内源乙烯合成途径中的限速酶和关键酶，由多基因家族编码。目前，在拟南芥、番茄、水稻和枇杷等作物中均有关于ACS基因的研究报道，而在茄子中至今未有相关的ACS基因的研究报道。本研究中，对推测的茄子SmACS基因编码的氨基酸序列在NCBI 数据库中进行Blastp比对，发现SmACS蛋白与其他物种的ACS蛋白同源性很高，其中与大豆的同源性最高（69.98%），与同属茄科的番茄ACS 的同源性为69.65%，略低于大豆的，可能是由于ACC 合成酶是由多基因家族编码，而SmACS 氨基酸序列与番茄的ACS 氨基酸序列差异较大，导致2 个物种的同源性较低，这与吴建阳等[20]对荔枝的研究结果类似。进一步的同源比对分析显示，SmACS编码的氨基酸序列比较保守，含有7个保守结构域、11个转氨酶中保守的氨基酸以及与底物特异性有关的保守谷氨酸残基，这与荔枝ACS1基因的研究结果[20]一致。

茄子SmACS基因包含4 个外显子和3 个内含子，属典型的ACS基因结构，这与牡丹中ACS基因结构的研究结果[28]一致。对SmACS 蛋白质的理化性质分析发现，茄子SmACS蛋白由478个氨基酸组成，等电点为6.48，分子质量为54.03 kDa，为定位于细胞质中的不稳定的非分泌型亲水蛋白，这与牡丹ACS基因的研究结果[28]基本一致。

图10 茄子SmACS基因响应逆境胁迫的表达分析Fig.10 Expression analysis of SmACS gene from eggplant in response to adversity stresses

对启动子元件的分析发现，茄子SmACS基因主要含有乙烯、脱落酸和冷胁迫相关的顺式作用元件。ACS基因可受脱落酸、乙烯、细胞分裂素和赤霉素等激素的诱导而表达，如乙烯能够诱导甘蔗基因Sc2ACS1、Sc2ACS2、Sc2ACS3的上调表达，并且甘蔗基因Sc2ACS1还可受冷胁迫的诱导而上调表达[23]。推测茄子SmACS基因可能在果实发育、冷胁迫和脱落酸响应中具有重要的调控作用。qRT-PCR 结果证实，茄子SmACS基因可受不同逆境胁迫诱导而表达，其中低温胁迫时诱导表达上调最显著。而有关SmACS基因在果实发育和脱落酸处理时的表达情况还有待进一步研究分析。

4 结论

研究发现，茄子ACC 合成酶基因SmACS位于第8 号染色体上，基因全长3 550 bp，编码序列长1 437 bp，含有3 个内含子和4 个外显子，属典型的ACS基因结构。其编码的蛋白质由478个氨基酸组成，是一种定位于细胞质的不稳定的非分泌型亲水蛋白，主要构成元件为α-螺旋和无规则卷曲，具有保守的Aminotran_1_2 结构域，含有39 个磷酸化位点，其中以丝氨酸和苏氨酸为主。茄子ACC合成酶与ACC 氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和抗坏血酸依赖性氧化还原酶发生相互作用。该基因启动子中含有与乙烯、脱落酸和非生物胁迫等有关的顺式作用元件；qRT-PCR结果表明，SmACS基因可受非生物胁迫（低温、高温、干旱和盐）诱导而表达，其中低温处理时诱导表达上调最显著，但有关SmACS基因在乙烯和脱落酸处理时的表达情况还有待进一步研究分析。