浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病毒与蜂房球菌感染情况调查

王德前，黄敏婕，郭海坤，方勐鸽，李君竹，董捷*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；2.浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，杭州 310021；3.浙江省淳安千岛湖方兴中蜂专业合作社，杭州 311701；4.浙江省淳安千岛湖好清蜜蜜蜂专业合作社，杭州 311701）

养蜂业是我国一项传统的绿色产业，其不但通过蜜蜂为农作物授粉带来巨大的经济效益和生态效益，而且可以向社会提供丰富的蜂产品，帮助农民脱贫致富。近些年来，养蜂业在全国各地山区精准扶贫工作中发挥了突出的作用[1]。浙江省淳安县地处浙西山地丘陵区，是新安江和千岛湖交汇处，拥有著名的杭州千岛湖景区。该地区温暖湿润，雨量充沛，全县森林覆盖率达75.27%，位居全省首位，动植物等生态资源十分丰富[2]。随着浙江省绿色生态农业发展和乡村振兴战略的深入推进，淳安县中华蜜蜂（中蜂）饲养量呈现出逐年递增的趋势。据2016 年调查，淳安县各乡镇均有蜜蜂养殖，蜜蜂养殖量已达2万多群，产值3 000余万元。中蜂产业的快速发展不但改善了当地农民的收入，而且在维持生态平衡中发挥了重要作用[3-4]。

目前，淳安县中蜂饲养量仍在持续增加，但与此同时，蜜蜂病害的发生率以及中蜂逃群现象也随之增多。其中，中华蜜蜂囊状幼虫病（简称“中囊病”）是中蜂蜂群中一种严重的传染病，由中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）引起，该病害具有发病快且传播迅速的特点，生产中如果防控不及时，可造成严重损失，是中蜂主要病害之一[5]。另外，由于浙江省存在意蜂回乡越冬现象，意蜂和中蜂混养情况时有发生，造成蜂病交叉感染，致使中蜂患病率提高[6]。其中，欧洲幼虫腐臭病（简称“欧幼病”）则是由意蜂传染至中蜂的一种细菌病，由蜂房球菌（Melissococcus pluton）引起，该病害虽比中囊病致死率低，但生产中如果未采取有效防控措施，往往也会造成蜂群损失[7]。总之，中囊病和欧幼病是中蜂生产中2 种常见的主要病害，虽然它们的病原不同，但危害的对象均是幼虫。这2 种病害没有给成年工蜂带来明显症状，但工蜂却是这2 种幼虫病原的重要携带者和传播者。中囊病和欧幼病均通过蜂群内工蜂的清洁和饲喂等行为传播给幼虫，从而导致病害在蜂群内甚至不同蜂群和蜂场间传播，引起幼虫感染死亡。因此，蜂群内病原的存在和传播是病害发生的重要因素，将工蜂作为病害流行调查对象，通过分析工蜂病原携带情况，也是预测这2种病害发生、发展和流行的一种方法。

近年来，关于浙江省淳安县中蜂病害的流行调查已经取得了一些进展。2017 年冬季，董捷等[8]对浙江省淳安县17 个乡镇进行了中囊病的流行病学调查，发现有13 个乡镇中囊病病毒检测呈阳性，其中有6个乡镇病毒检出率超过50%，同时，发现在中蜂饲养密集和有意蜂混养的地方，中囊病病毒感染比例较高。同年，郭蕊等[9]对淳安县17 个乡镇中蜂欧幼病的流行情况也进行了调查，发现当地共有11个乡镇的蜂群检出蜂房球菌感染，其中5 个乡镇的病原检出率超过40%。这些研究结果表明，淳安县大部分地区的中蜂蜂群中，中囊病和欧幼病的病原均普遍存在。这是针对该地区秋冬季节开展的中蜂2 种主要病害流行情况的大面积普查，而这2 种病害在淳安县中蜂蜂群的全年发生动态情况仍然未知。因此，本研究选择蜂群内的工蜂作为病害调查对象，对浙江省淳安县中蜂蜂群中由工蜂携带的中囊病和欧幼病的病原情况进行了全年定期监测，同时，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）方法检测蜂群中囊病病毒载量的变化水平，从而分析浙江省淳安县千岛湖地区中蜂中2种主要病害的全年流行风险及其混合感染情况，为合理制定中蜂病害防控措施，防止中蜂病害大规模爆发提供科学指导，为进一步实现浙江省中华蜜蜂的健康养殖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究选择浙江省淳安县千岛湖地区5个中蜂定地饲养蜂场作为中蜂病原流行观测样品采集点，分别为威坪镇、千岛湖镇、金峰乡、临岐镇、宋村乡。采集时间为2019 年1 月—12 月，每月1 日—5 日在每个采集点采样，每个点采集5 群，全年共采集300群。每群采集蜂群内50～100 头工蜂活体，装入带有炼糖的蜂笼内并带回实验室，经液氮冷冻后置于－80 ℃冰箱中保存，备用。

1.2 主要试剂

总RNA/DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.®DNA/RNA Isolation Kit R6731-01）购自美国Omega公司；反转录试剂盒（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 6110A）与荧光定量PCR试剂（TB Green®Premix Ex TaqTMⅡRR820A）均购自宝生物工程（大连）有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、感受态细胞（Trans1-T1）、PCR 产物纯化试剂盒和质粒DNA 小量抽提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品DNA 和RNA 的提取

在采集的样品中每群取工蜂20头，在液氮中研磨成混合粉末，参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取样品的总DNA 和总RNA，保存于－80 ℃冰箱中，备用。

1.3.2 中囊病与欧幼病检测与分析

参考董捷等[8]报道的中囊病检测方法，利用反转录-聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR）技术检测中囊病病毒；参考郭蕊等[9]报道的欧幼病检测方法，利用PCR方法检测蜂房球菌。病原检测的引物信息见表1。分析检测结果，分别对1月—12月病原调查中不同取样点蜂群病原阳性检出数量进行统计，绘制工蜂中中囊病和欧幼病病原检出率的全年变化图。

表1 中囊病病毒和欧幼病病原检测的引物信息Table 1 Primer information used for detecting Chinese sacbrood virus(CSBV)and European foulbrood disease(EFB)pathogens

1.3.3 中囊病病毒绝对定量

根据1.3.2 节的样品检测结果，选择同一时期CSBV 检测为阳性的蜂群，然后根据蜂房球菌检测结果将这些CSBV 检测呈阳性的蜂群进行分组，其中，未检出蜂房球菌的为CSBV组，检出蜂房球菌的为CSBV＋EFB组；采用RT-PCR方法对不同时期2组蜂群内中囊病病毒的拷贝数进行分析。

参考陈功文等[10]报道的病毒绝对定量方法和步骤进行CSBV拷贝数分析，以GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）公布的浙江省来源的CSBV-ZJ 病毒全基因组（登录号：MH509439）为参考序列，利用Primer premier 5.0设计特异性RT-qPCR引物（表1）；经病毒质粒梯度荧光定量PCR试验，建立的CSBV病毒标准曲线为：yCSBV=－3.639x＋38.596，R2=0.999（y代表CT值，x代表病毒基因组拷贝数的常用对数，病毒基因组拷贝数为10x）。根据CSBV标准曲线，分别计算出细菌病毒混合感染和单一病毒感染蜂群样品中CSBV 病毒的拷贝数；利用统计软件SPSS 19.0 对样品间的差异情况进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 浙江省淳安县中囊病病毒全年流行规律

为调查浙江省淳安县中囊病病毒流行规律，对该地区的5 个中蜂饲养点进行了12 个月的定点取样。结果（图1）显示：从一年的越冬结束至春繁开始时，3月的蜂群内CSBV的感染率最高，为84%，随后逐渐降低，直到7 月病毒感染率降到最低，为12%，然后随着秋繁开始，CSBV 的感染率开始升高，一直延续到冬季。

图1 浙江省淳安县中囊病病毒全年检出率调查Fig.1 Investigation of CSBV positive rates in Chun’an County of Zhejiang Province during the whole year

2.2 浙江省淳安县欧幼病病原全年流行规律

为调查浙江省淳安县中蜂欧幼病病原流行规律，对该地区的5个中蜂饲养点进行了12个月的定点取样。结果（图2）显示：随着春繁开始，蜂群内蜂房球菌的感染率逐渐上升，直到7 月开始下降；之后，随着秋繁开始，蜂房球菌的感染率再次上升，在10 月和11 月达到全年最高水平，为72%，而冬季蜂群内蜂房球菌的感染率略有下降。

2.3 浙江省淳安县中蜂的2 种病害混合感染变化规律

图2 浙江省淳安县欧幼病病原蜂房球菌全年检出率调查Fig.2 Investigation of EFB positive rates in Chun’an County of Zhejiang Province during the whole year

经统计分析蜂群中囊病病毒和欧幼病病原全年检出比例，结果（图3）发现：春季是中囊病（病毒病）的高发季节，秋季是欧幼病（细菌病）的高发季节；中囊病和欧幼病共同发生的现象存在于全年的每个季节，其中在秋季病原混合感染比例最高，为17%；而健康蜂群比例较高的时期是夏季。

2.4 细菌病对蜂群中囊病病毒载量的影响

为了明确浙江省淳安县蜂群CSBV载量变化情况，同时，了解蜂群内的细菌病原是否影响病毒载量，本文采用绝对荧光定量的方法，对不同时期蜂群工蜂携带的CSBV 拷贝数进行了分析。结果（图4）发现：在一年四季中，蜂群内的CSBV载量均保持相对稳定的水平；在秋季，中囊病和欧幼病共同存在的蜂群内CSBV拷贝数显著地高于单一检出CSBV的蜂群，即欧幼病对CSBV载量影响显著（P<0.05），而在其余季节欧幼病对CSBV载量的影响均不显著。

3 讨论

图3 浙江省淳安县中囊病病毒和欧幼病病原全年检出率调查Fig.3 Investigation of CSBV and EFB positive rates in Chun’an County of Zhejiang Province during the whole year

图4 细菌病毒共感染蜂群与单一感染病毒蜂群CSBV拷贝数比较Fig.4 Comparison of CSBV copy number between cooccurrence of bacteria and virus and mono-occurrence of virus in honeybee colonies

本研究通过对浙江省淳安县千岛湖地区中蜂蜂群内的工蜂进行病原携带情况调查，获得了中囊病和欧幼病这2种中蜂主要病害的病原全年流行规律，填补了董捷等[8]和郭蕊等[9]只开展了冬季千岛湖地区中蜂病害调查，而对该地区其他季节病害流行情况未知的空白，同时，为合理制定淳安县中蜂病害全年防控措施提供了基础资料和参考依据，也对当地中蜂资源保护具有重要的意义。

中囊病是危害中蜂最为严重的病毒病之一，该病害目前没有特效的治疗药物，在生产中主要以预防为主[11]。因此，明确中囊病病原的全年流行规律，对于生产中指导蜜蜂饲养和预防病害发生至关重要。本研究发现，在浙江省淳安县千岛湖地区一年四季中，中囊病病毒（CSBV）在工蜂中的携带率呈现此消彼长的规律，全年表现为由高到低随后再升高的变化趋势。该病毒病在春季感染率处于最高水平，这个趋势与蜜蜂的春繁工作密切相关。春季气温处于不稳定状态，如果蜂群群势调整不当，往往会造成蜂群内CSBV的扩散，导致中囊病爆发，造成损失。到了炎热夏季，病毒感染率出现下降趋势，夏末秋初，CSBV 又出现短时上涨，直到冬季该病毒感染率才有所下降。此次调查结果与中囊病的一般发病时期基本一致，即气候变化大，温湿度不稳定时，处于繁殖期的蜂群容易发病。这与吴政报道的其他地区中蜂病害流行调查结果[12]一致。综合中囊病发病规律，在早春和越冬期做好中蜂保温工作，发病前完成换王，是中囊病防治工作的关键。

欧幼病是由意大利蜜蜂传入中蜂蜂群的一种细菌病。据报道，该病害一般在春末夏初和夏末秋初感染率处于较高水平，基本与蜂群繁殖高峰期相重叠，即与春繁、秋繁相重叠；大流蜜期到来的时候，该病害常常“自愈”，其原因与群内待哺幼虫数量减少有关[13]。本研究开展中蜂病害调查的地点是浙江省淳安县千岛湖地区，发现该地区蜂群欧幼病在春季的感染率较低，与该病害的一般发病规律不同。这可能与当地蜂群饲养方式有关，因为蜂房球菌的传播主要是由蜜蜂的采集活动和养蜂者不合理的操作引起的，而该地区的中蜂饲养与意大利蜜蜂的大规模饲养不同，该地中蜂蜂群往往都是采取传统的定地放养模式，一般一年取蜜1～2 次，蜂群受人为干扰因素相对较少。

大多数蜜蜂研究者一致认为，蜂群损失不能归因于单一的因素，而是不同生物及非生物压力源相互作用的结果[14]。病毒与细菌等病原的混合感染，往往是人类或家畜疾病防控难的主要因素，在蜜蜂中也不例外。本研究发现，中囊病（病毒病）和欧幼病（细菌病）这2种病害的病原在中蜂蜂群内表现出共同存在的现象。这2 种病害均是从感染1—2 日龄小幼虫开始，虽然致病机制不同，但是本研究结果发现：秋季蜂群内2种病害共同存在情况的出现，会引起蜂群内CSBV 载量显著升高的现象，表明在细菌和病毒这2 种同为蜜蜂幼虫致病的病原之间，在特定条件下可能存在相互促进的现象。因此，二者之间是否存在相互促进致病的关系及其作用机制仍有待深入研究。

4 结论

本研究通过对中蜂中囊病和欧幼病这2种幼虫病在蜂群内的病原重要传播者——工蜂进行了病原调查与检测，明确了在浙江省淳安县千岛湖地区的中蜂中这2 种主要病原在蜂群内的全年流行情况。研究发现：该地区中囊病和欧幼病的病原在工蜂中的携带情况具有明显的季节性，春季中囊病病原CSBV 检出率最高，秋季欧幼病病原蜂房球菌检出率最高；同时，这2种病原在蜂群中均存在混合感染的情况，且2 种病原共同存在会引起秋季蜂群内CSBV载量显著升高。这些结果可为合理制定淳安县中蜂病害的全年防治措施提供科学依据。