RLP76、Wip⁃1及Gal⁃9在子宫内膜癌的表达及与细胞凋亡的相关性

王丽娜 史凤菊 娄艳辉

作者单位：枣庄市山亭区人民医院，山东，枣庄277100

子宫内膜癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，近年来该病发病率在世界各国均有增高趋势，且发病年龄也呈年轻化发展，严重危害女性的生命健康［1］。RLP76 是Ras 超家族成员，定位于人18号染色体。国外文献报道，RalA 可作为膜蛋白转运体调控细胞内过氧化脂质体水平，调控细胞增殖、分化及凋亡，与恶性肿瘤发生、进展相关［2］。野生型p53 诱导磷酸酶1（Wild type p53 inducible phosphatase 1，Wip⁃1）对p53 起负性调控作用，诱导p53 突变。已有文献证实，Wip⁃1与子宫内膜癌增殖、凋亡有关［3］。半乳凝素⁃9（Galectin⁃9，Gal⁃9）可通过抑制T 细胞活化和增殖负性调控机体免疫应答，其与子宫内膜癌的关系研究较多［4］，但尚未有明确定论。本研究旨在探讨RLP76、Wip⁃1及Gal⁃9 在子宫内膜癌的表达情况，以期为临床开展子宫内膜癌机制研究提供基础资料，现研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年12月至2016年12月在本院收治的64 例子宫内膜癌患者（共64 份子宫内膜癌标本）作为子宫内膜癌组。平均年龄（56.41±5.74）岁；根据国际妇产科联盟（International Federation of Gynaecology and Obstetrics，FIGO）分期［5］：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例。纳入标准：①均经手术或实验室检查确诊为子宫内膜癌［6］；②均为初次确诊子宫内膜癌的患者，纳入研究前未接受放化疗治疗；③无手术禁忌症；④所有患者均已签署知情同意书；⑤本研究经本院伦理委员会审核通过（QDDXFSYY⁃2017015）。排除标准：①精神病史者；②合并其他妇科恶性肿瘤、其他系统恶性肿瘤者；③复发或已接受过其他治疗的子宫内膜癌和患者。

选取同期在本院进行手术治疗的子宫内膜不典型增生患者68 例（共68 份子宫内膜不典型增生标本）设为对照组。平均年龄（56.21±5.66）岁。2 组患者基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 RLP76 及Gal⁃9 检测方法

采用S⁃P 免疫组化染色。将子宫内膜癌组、对照组标本经常规石蜡切片、脱水。RLP76、Gal⁃9兔多克隆抗体均采购自美国Epitomics 公司。免疫组化染色结果判定［7］：结合阳性细胞百分比和染色强度判定对结果进行判定。阳性细胞百分比为0 计0 分，≤10%计1 分，>10%～25%计2分，>25%～50%计3 分，>50%计4 分；细胞质无染色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分；两项评分之和≤2 分为阴性，≥3 分为阳性。

1.2.2Wip⁃1表达量检测方法

采用实时荧光定量PCR 技术检测。取转染培养的ECC⁃1 和KLE 细胞，加入细胞裂解液，按照Trizol 总RNA 提取试剂盒说明对总RNA 进行提取，并检测纯度。用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为模板链cDNA，以cDNA 为模板，按照PCR 试剂盒要求进行PCR。wip⁃1引物：上游5′⁃GTT CGT AGCAAT GCC TTC TCA⁃3′，下游5′⁃CAC TTT CTT GGG CTTTCA TTT G⁃3′；β⁃actin 引物：上游5′⁃CAC TGT GTT GGCGTA CAG GTC T⁃3 7，下游5′⁃GCG AGA TGA CCC AGATcA T⁃3′。PCR反应条件：94℃2 min；92℃60 S，56℃30 S，74℃30 s，连续进行38 个循环。每份样品均设置3 个平行反应复孔。根据Lipofectimane 2000 脂质体转染试剂盒将细胞进行转染，分为抑制组、阴性对照组、空白对照组。Wipr1 siRNA 组细胞转染Wip⁃1siRNA 质粒，Wip⁃1特异性siRNA 靶序列：5′⁃CCA ATG AAG ATGAGT TAT G⁃3′ i。siRNA 对照组细胞转染Wip⁃1siRNA 基因无同源性的阴性对照序列：5′⁃CTG GAC TTT CAG AAG AACA⁃3′。空白对照组细胞转染空白质粒。以内参为参考，用2⁃△△Ct法获得子宫内膜癌标本和子宫内膜不典型增生组织及抑制组、阴性对照组、空白对照组中Wip⁃1表达量。Wip⁃1：≧1.8 视为异常增高［6］。

1.2.3 随访

以电话随访及门诊复查的方式对患者随访4年，随访截止时间2020年12月，了解患者预后情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料通过n（%）表示，采用χ2检验；采用Pearson 直线相关分析RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1与子宫内膜癌患者细胞凋亡的相关性；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者RLP76、Gal⁃9及Wip⁃1表达情况比较

子宫内膜癌组RLP76 和Gal⁃9 阳性率及Wip⁃1表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组患者RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况比较［（n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of rlp76，Gal⁃9 and wip⁃1 gene in two groups［（n（%），（±s）］

表1 两组患者RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况比较［（n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of rlp76，Gal⁃9 and wip⁃1 gene in two groups［（n（%），（±s）］

分组子宫内膜癌组对照组t/χ2值P 值n Wip⁃1 64 68 RLP76阳性51（79.69）35（51.47）11.562<0.001阴性13（20.31）33（48.53）Gal⁃9阳性49（76.56）30（44.12）14.443<0.001阴性15（13.44）38（55.88）2.40±0.19 1.48±0.15<0.001

2.2 子宫内膜癌组患者RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况与病理特征的关系

有淋巴结转移的患者RLP76 和Gal⁃9 阳性率及Wip⁃1表达量显著高于无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 子宫内膜癌组患者RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况与病理特征的关系［n（%），（±s）］Table 2 the relationship between the expression of rlp76，Gal⁃9 and wip⁃1 gene and pathological features in endometrial carcinoma［n（%），（±s）］

表2 子宫内膜癌组患者RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况与病理特征的关系［n（%），（±s）］Table 2 the relationship between the expression of rlp76，Gal⁃9 and wip⁃1 gene and pathological features in endometrial carcinoma［n（%），（±s）］

病理指标χ2值P 值χ2值P 值Wip⁃1 t 值P 值年龄（岁）0.002 0.960 0.4760.490 0.957 0.342病理分级1.121 0.290 0.0250.875 1.292 0.201 FIGO 分期≧50<50Ⅰ～ⅡⅢ～ⅣⅠ～ⅡⅢ～Ⅳ3.274 0.070 0.3720.542 0.873 0.386组织学分级G1 2.098 0.148 0.1610.688 1.160 0.321淋巴结转移G2 G3有无例数（n=64）25 39 33 31 30 34 17 26 21 40 24 RLP76阳性（n=51）20（39.22）31（60.78）28（54.90）23（45.10）21（41.18）30（58.82）12（23.53）19（37.25）20（39.22）37（72.55）14（27.45）阴性（n=13）5（38.46）8（61.54）5（38.46）8（61.54）9（69.23）4（30.77）5（38.46）7（53.85）1（7.69）3（23.08）10（76.92）10.818 0.001 Gal⁃9阳性（n=49）18（36.73）31（63.25）25（51.02）24（48.95）24（48.95）25（51.02）9（18.37）20（40.82）20（40.82）35（71.43）14（28.57）阴性（n=15）7（46.67）8（53.33）8（53.33）7（46.67）6（40.00）9（60.00）8（53.33）6（60.00）1（6.67）5（33.33）10（66.67）7.1110.008 2.02±0.42 1.92±0.40 1.95±0.46 2.11±0.53 2.07±0.39 2.16±0.43 1.93±0.32 2.02±0.35 2.11±0.41 2.64±0.27 1.93±0.15 11.811<0.001

2.3 不同转染组细胞中RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况比较

抑制组RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1表达量显著高于阴性对照组及空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 不同转染组细胞中RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况比较（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates of rlp76，Gal⁃9 and wip⁃1 gene in different transfection groups（±s）

表3 不同转染组细胞中RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 表达情况比较（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates of rlp76，Gal⁃9 and wip⁃1 gene in different transfection groups（±s）

注：与抑制组比较，aP<0.05。

组别抑制组阴性对照组空白对照组F 值P 值RLP76 33.25±3.29 14.16±3.12a 13.88±2.99a 802.430<0.001 Gal⁃9 38.64±3.41 15.31±2.93a 14.93±2.80a 1262.290<0.001 Wip⁃1 17.85±1.18 5.14±0.40a 5.37±0.52a 5571.160<0.001

2.4 RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 与子宫内膜癌组患者细胞凋亡率的相关性

Pearson 相关性显示，RLP76（r=0.781）、Gal⁃9（r=0.773）及Wip⁃1（r=0.836）与子宫内膜癌组患者细胞凋亡率呈正相关（P<0.05）。

2.5 RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 与子宫内膜癌组患者预后的关系

随访结果显示，子宫内膜癌患者预后四年死亡率为65.63%（42/64）。RLP76 阳性、Gal⁃9 阳性及Wip⁃1高表达的患者死亡率显著高于RLP76 阴性、Gal⁃9 阴性及Wip⁃1低表达的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 RLP76、Gal⁃9 及Wip⁃1 与子宫内膜癌组患者预后的关系［n（%）］Table 4 Relationship between rlp76，Gal⁃9，wip⁃1 gene and prognosis of endometrial carcinoma［n（%）］

3 讨论

尽管近年来诊疗子宫内膜癌的手段已得到显著进步，但患者5年预后生存率仍较低。肿瘤细胞侵袭、转移是子宫内膜癌患者预后较差的主要原因，随着疾病的进展及细胞内相关基因表达的变化，细胞凋亡受到抑制，导致宫颈上皮细胞平衡被破坏从而引发癌变。寻找参与肿瘤侵袭、转移过程中的有效标志物对评估子宫内膜癌患者病情进展、预后具有重要参考价值。

RLP76 调控细胞生长、迁移、分裂和凋亡，主要表达于乳腺、心脏、肝脏和红细胞中。Ngoi N 等学者［8］研究指出，RLP76 在肿瘤组织中表达异常增高，在多种信号通路中发挥关键性调控作用，参与细胞增殖、迁移。本研究发现，子宫内膜癌组织中RLP76阳性表达率显著高于子宫内膜不典型增生组织标本，且RLP76 阳性表达的患者淋巴结转移风险更大，进一步证实上述观点。本研究还发现抑制组RLP76 细胞凋亡率高于阴性对照组和空白对照组，与既往文献报道结果一致［9］，提示RLP76 可促使子宫内膜癌细胞凋亡。考虑为RLP76 通过上调凋亡抑制因子表达、抑制凋亡相关基因表达，从而使子宫内膜癌细胞躲避凋亡程序，实现异常增殖所致。

大量研究证实，Wip⁃1能够通过直接或间接路径使抑癌基因p53磷酸化进程被抑制，从而使p53失活，给肿瘤的发生、发展提供了有利环境［10］。相关研究报道，在甲状腺癌、小细胞肺癌、子宫内膜癌组织中，Wip⁃1呈高表达状态，与恶性肿瘤淋巴结转移、肿瘤临床分期有显著相关性，高表达的Wip⁃1可打破机体内环境稳定，影响p53 活性，促进肿瘤发生、细胞凋亡［11］。

Gal⁃9 蛋白在细胞质、细胞外基质及细胞核内均有分布，研究表明，前列腺癌、肾癌、胃癌等多种癌组织中层强阳性表达［12］。Joly 等学者［13］报道Gal⁃9 蛋白在宫颈上皮细胞不典型增生至癌变过程中凸显重要作用。国内学者报道，Gal⁃9 可诱导胸腺细胞、T 细胞及巨噬细胞的凋亡，同时对肿瘤细胞凋亡、转移等发挥了一定作用，与本研究得出结果一致［14］。同时，本研究还发现，RLP76、Gal⁃9蛋白及Wip⁃1与子宫内膜癌组患者细胞凋亡率呈正相关。提示，随着细胞凋亡的发生，RLP76、Gal⁃9蛋白及Wip⁃1表达量逐渐升高。表明子宫内膜癌患者在对抗肿瘤发生发展的过程中，可能受到RLP76、Gal⁃9 蛋白及Wip⁃1等因素的影响，导致细胞凋亡、增殖的平衡被打破［15］。

综上所述，子宫内膜癌组织中RLP76、Gal⁃9 蛋白及Wip⁃1表达与患者淋巴结转移密切相关，且与细胞凋亡率呈正相关。提示三者对子宫内膜癌患者细胞凋亡产生影响，对明确子宫内膜癌患者淋巴结转移情况有重要评估价值，检测RLP76、Gal⁃9 蛋白及Wip⁃1可为临床评估病情进展和诊疗效果提供可靠依据。后续笔者将扩大样本量，进一步分析子宫内膜癌细胞增殖、凋亡等生物学过程。