多靶点酪氨酸激酶抑制剂阿西替尼治疗肝纤维化的作用与机制

刘司南，黄子超，毕文超，崔瑞霞，曲 凯，刘 昌

(1. 西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061；2. 陕西省肿瘤医院，陕西西安 710061；3. 西安交通大学附属红会医院，陕西西安 710054)

肝硬化是世界范围内的重要健康问题，尚缺乏有效治疗[1-2]。肝移植是目前唯一根治方法，但并不能满足临床需求[3]。肝纤维化是肝硬化的早期状态，是肝脏损伤后，炎症迁延所致的过度修复反应[4-5]。已证实肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纤维化发生发展中起关键作用。肝脏损伤后，炎症介质促进HSC活化、增生[6]，产生胶原为主的细胞外基质(extracellular metrics, ECM)，引起肝脏结构重塑[7-8]。因此，抑制活化的HSC成为治疗肝纤维化的重要切入点[9]。研究表明，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等多种细胞因子，与HSC表面的特异受体结合会激活HSC[10]。其中，PDGF是HSC最强的有丝分裂原，通过与HSC表面的受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinases, RTKs)结合，促进HSC活化、增殖[11]，VEGF作用机制与其相仿。

阿西替尼(Axitinib)是新一代强效的多靶点酪氨酸激酶受体抑制剂，可靶向阻滞PDGFR和VEGFR-1/2/3，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡，目前已应用于肾癌、结肠癌的治疗[12-14]。据此推断其可能影响活化HSC的细胞活性及细胞凋亡而在肝纤维化治疗中发挥作用。本研究通过观察阿西替尼对CCL4诱导的小鼠肝组织纤维增生的影响以及对体外HSC系(LX2)细胞活性及细胞凋亡的影响，探究其在抗肝纤维化治疗中的作用，为肝硬化的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物阿西替尼(AG-013736)购自美国辉瑞公司。8周龄C57BL/6小鼠48只(西安交通大学医学部实验动物中心提供)，体质量25～35 g，清洁级，按12 h/12 h明暗周期饲养。人肝细胞系LO2细胞购自中科院上海细胞库，人LX2购自湖南湘雅医学院中心实验室细胞库。

1.2 造模及分组与取材应用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCL4)橄榄油溶液2 mL/kg腹腔注射，每周2次，连续4周，诱导小鼠肝脏纤维化模型。实验分为6组(各组n=8)。对照组仅腹腔注射2 mL/kg的橄榄油，每周2次，连续4周；CCl4造模2周组、4周组，用CCl4橄榄油溶液分别造模处理2周、4周后处死，阿西替尼治疗1周组、2周组于造模4周时给予阿西替尼CMC稀释液600 μg/只灌胃，每周2次，分别共给药1周、2周时处死；CMC对照组于造模4周时给予CMC 10 mg/mL的工作液灌胃2周(2次/周)。于各组处理终点处死小鼠后取材肝组织，以100 mL/L甲醛固定，制作石蜡切片，进行后续分析。

1.3 肝组织切片染色对各组切片进行HE染色与Masson染色，显微镜下观察。光镜下，胶原纤维被染成蓝绿色，每样本随机选取15个高倍视野(200×)，采用Motic Med数码医学图像分析系统进行胶原纤维阳性面积半定量，分析判断胶原面积密度变化。

α-SMA免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡，修复抗原，30 mL/L过氧化氢阻断后，鼠单抗α-SMA(美国Santa Cruz公司)，4 ℃过夜，按照SP法试剂盒(中山生物)说明书操作，DAB(中杉金桥)显色。苏木精复染细胞核，脱水、透明、封固，显微镜下拍照观察蛋白定位、评分、阳性染色面积分析。结果判定：每张切片均匀区域随机选取5个高倍视野，细胞数≥1 000/视野。观察每个视野细胞中的阳性细胞以及染色强弱度，计算组织切片免疫组化得分(immunohistochemical score, IHS)，根据Remmele和Stegner提出的免疫反应积分(IRS)打分法，使用染色强度(Sl)及阳性细胞百分比(PP)计算：公式即IRS=SI×PP[15]。

1.4 MTT检测细胞活性复苏LO2细胞及LX2细胞后培养、传代，同步后种入96孔板进行实验分组。调零组仅加入培养基，对照组为培养基+同步化细胞，不同干预浓度的药物实验组为培养基+某浓度阿西替尼+同步化细胞，于培养48、72 h时分别取96孔板，加入20 μL MTT溶液，再培养4 h，终止并加入150 μL DMSO，震荡混匀，放入酶标仪检测。每组设置5个复孔，计算各组的平均值，计算IC50，绘制抑制率曲线。

1.5 Annexin-V/PI联合标记流式细胞术检测细胞凋亡LO2细胞及LX2细胞同步化后种于6孔板，分为溶剂对照组及62.5、250、500、1 000 μmol/L阿西替尼组分别进行干预。于48、72 h时收集细胞，漂洗后进行Annexin-V染色(按照Annexin-V/PI联合标记流式细胞术检测试剂盒进行)，将细胞吹打成单细胞悬液。置于488 nm波长激发光的流式细胞仪上进行凋亡检测，上机测定时获取1×104个以上细胞，重复2次后分析结果。

1.6 Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达按照1.4项中分组干预细胞48 h，裂解细胞离心后收集蛋白并测定浓度。制备100 g/L聚丙烯酰胺凝胶，上样后90 V电泳90 min后，于250 mA，湿转90 min至PVDF膜，100 g/L PBST脱脂牛奶封闭2 h，一抗孵育过夜(Caspase3，1∶1 000；Fas，1∶3 000；Bcl-2，1∶2 000；Caspas8，1∶500；β-actin，1∶5 000)，PBST洗膜3次，10 min/次，二抗孵育1 h(先锋生物，1∶10 000)，再次洗膜3次，步骤同前。最后进行暗室发光并采集图像，应用蛋白灰度与内参灰度值的比值进行统计分析。

2 结 果

2.1 CCL4诱导小鼠肝纤维化的组织病理学观察肝脏组织HE染色显示(图1)：对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞形态正常。CCL4造模2周组肝组织正常小叶结构破坏，汇管区及中央静脉增多，炎细胞浸润；造模4周组肝细胞大片坏死并被白色纤维结缔组织取代，小叶结构消失。

图1 小鼠肝脏组织病理学HE染色

2.2 Masson染色结果Masson染色结果显示，与对照组相比，CCL4造模组可见胶原纤维为主的ECM明显增多，分布于汇管区及中央静脉周围，并伸入肝小叶内包绕肝细胞形成假小叶，肝小叶结构丧失；阿西替尼治疗1周组和治疗2周组的小鼠肝组织中央静脉周围和汇管区胶原纤维较前减少；CCL4造模2周组、4周组的胶原面积密度半定量测定分别为(13.67±0.68)%、(24.43±4.21)%，明显高于对照组的(1.73±0.31)%，差异具有统计学意义(P<0.05)；阿西替尼治疗1周组及治疗2周组分别为(17.63±1.51)%、(11.15±1.242)%，明显低于造模4周组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；而CMC对照组的胶原面积密度为(27.09±3.07)%，与造模4周组比较差异不明显(P>0.05，图2)。

2.3 各组小鼠肝组织中α-SMA的表达变化免疫组织化学染色结果显示，CCL4造模2周组、4周组的小鼠肝脏组织α-SMA 阳性染色面积比率分别为(4.92±0.30)%、(30.62±9.14)%，免疫反应积分(IRS)分别为(1.6±0.2)和(5.0±0.4)分；而阿西替尼治疗1周组、2周组阳性面积比率及免疫反应积则分别为(11.12±0.31)%、(6.93±1.08)%和(3.07±0.42)、(1.67±0.42)分，α-SMA阳性表达呈下降趋势。与CCL4造模4周组及CMC对照组[(28.52±6.23)%、(5.27±0.11)分]的差异均存在统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 小鼠肝组织α-SMA免疫组化染色(200×)

2.4 阿西替尼对肝细胞活性及凋亡的作用MTT实验结果显示，阿西替尼各浓度组间的LX2抑制率差异具有统计学意义(P<0.001)。干预48、72 h，阿西替尼对LX2活性的50%抑制浓度(IC50)分别为127.6、284.5 nmol/L。LX2抑制率的拟合曲线显示，阿西替尼对LX2细胞活性的48、72 h抑制作用均随着药物浓度增高而逐渐增高(图4A、4B)。而对LO2组细胞活性抑制作用不显著，仅高浓度组(1 000 nmol/L)同未干预组差异有统计学意义(P<0.05)。

流式细胞仪检测显示，与对照溶剂组比较，250 nmol/L阿西替尼干预组48 h时的LX2细胞凋亡率即开始升高，且凋亡率随着各干预组浓度增加而增高，72 h时抑制作用更加明显(图4C)。而LO2组干预48、72 h，低浓度各组凋亡率与对照溶剂组差异不具有统计学意义(P>0.05)，仅浓度达500、1 000 nmol/L时凋亡率与溶剂对照组的差异具有统计学意义(P<0.05，图4D)。

图2 各组肝脏组织Masson染色(200×)及胶原沉积面积(面积密度%)的比较Fig.2 Masson staining (200×) and collagen deposition area (area density%) in liver tissue胶原沉积染色为蓝绿色。A:对照组;B:CCL4造模2周组;C:CCL4造模4周组;D:CMC对照组;E:阿西替尼治疗1周组;F:阿西替尼治疗2周组;G:统计学分析。ns:两组间差异无统计学意义。

图4 阿西替尼作用于肝星状细胞系LX2和肝细胞系LO2的影响

2.5 LX2细胞中凋亡相关蛋白的表达变化Western blotting检测显示，与溶剂对照组比较，阿西替尼干预LX248 h，自250 nmol/L浓度组开始，各组Fas、Caspase-8及Caspase-3表达差异有统计学意义(P<0.001)；各浓度组Fas、Caspase-8以及Caspase-3蛋白表达均上调，而Bcl-2明显下调，且与药物浓度存在依赖关系；而LO2细胞株各浓度组蛋白表达与对照组差异不明显，仅1 000 nmol/L高浓度组有差异(P<0.05，图5)。

图5 Western blotting检测阿西替尼处理的LX2(A)及LO2细胞(B)中凋亡相关蛋白的表达

3 讨 论

HSC是肝纤维化反应的重要效应器，也是细胞因子的主要来源和靶点[16]。慢性肝病中，细胞因子的释放刺激HSC活化和增殖，通过自分泌或旁分泌方式释放PDGF等因子并表达相应的受体，导致胶原等ECM过量沉积，促进肝纤维化的发生进展[17-18]。研究发现，静止的HSC并不表达PDGFR，仅当其活化后才会表达[19-21]。抑制酪氨酸激酶受体PDGFR、VEGFR活性，可能引起活化的HSC的系列变化，进而影响肝纤维化的进一步进展。阿西替尼为一种多靶点酪氨酸激酶受体抑制剂，能够阻止多个酪氨酸激酶受体活性，可能诱导活化的HSC凋亡，发挥抗纤维化作用。本研究发现，CCL4可以诱导小鼠肝纤维化，且随着时间延长，肝纤维化程度逐渐加重。同时，Masson染色结果显示，应用阿西替尼治疗组小鼠肝脏胶原沉积面积较溶剂对照组和造模组大幅下降，提示阿西替尼可以改善CCL4诱导的肝纤维化模型的胶原组织增生状况。这一结果与MEJIAS等[19]应用索拉非尼治疗胆管结扎(BDL)大鼠的实验结果类似。

活化的HSC产生胶原等ECM的累积可导致肝纤维化形成。为明确阿西替尼治疗时胶原沉积减少是否与其影响活化的HSC有关，进而应用免疫组化实验标记已知的HSC的活化标记物α-SMA观察阿西替尼干预小鼠肝脏活化HSC的表达，结果显示，阿西替尼组肝组织α-SMA阳性细胞(活化的HSC)面积比率较CCL44周造模组及CMC对照组显著降低，这提示阿西替尼通过使活化的HSC减少而抑制肝纤维化进程。

酪氨酸激酶抑制剂如尼罗替尼、索拉非尼等能够通过影响活化HSC而发挥一定的抗肝纤维化作用[22-23]。本研究进一步通过MTT实验证实阿西替尼严重抑制肝星状细胞系LX2的细胞活性，且效应具有浓度依赖性。据此推测，阿西替尼可能通过影响活化HSC的活性发挥抗纤维化作用。研究报道，活化的HSC中NF-κB通路激活，诱导抗凋亡蛋白如Bcl-2等表达升高，从而抵抗细胞死亡刺激[24]。有文献报道，诱导活化的HSC凋亡可减轻肝纤维化[25]，因此，诱导HSC细胞死亡对肝纤维化的治疗具有潜在价值。本研究通过流式细胞仪检测发现，不同浓度阿西替尼干预LX2后，其凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)明显增加。这证实了阿西替尼可诱导活化的HSC发生凋亡。本研究还检测凋亡相关蛋白的表达，发现阿西替尼诱导HCS凋亡的机制可能是通过Fas/Fas-L激活一系列Caspase家族的酶联反应和下调Bcl-2/Bax而实现的。此外，实验设置的LO2对照组被阿西替尼抑制的IC50范围远大于LX2，且仅较高浓度时凋亡相关蛋白才显示出差异。这提示在一定浓度范围内，阿西替尼治疗较为安全。产生这种现象的原因可能是因为HSC激活后其表面表达PDGFR、VEGFR等多种酪氨酸受体激酶，导致其对于阿西替尼药物敏感性增高所致，但尚需进一步的实验进行验证。

综上所述，本研究初步验证了阿西替尼可以通过抑制活化的HSC活性，诱导其凋亡，发挥抗肝纤维化作用，且在合适的剂量范围内阿西替尼对肝星状细胞的抑制作用不会引起正常肝细胞的损伤和凋亡。这为阿西替尼治疗肝纤维化的临床应用奠定了基础，但还需进一步实验研究其具体机制和治疗安全性。