祛痰活血方对非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝组织miR-27a、p38MAPK、AQP9表达的影响

杨昌碧，汪静，郑丁

西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除过量饮酒和其他明确导致肝损伤因素外所致的肝细胞内脂肪过量沉积，是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤[1]。NAFLD发病机制复杂，公认的是以胰岛素抵抗为中心的“二次打击”学说[2]，胰岛素抵抗导致的脂代谢紊乱及肝脏中三酰甘油（TG）过度沉积是NAFLD的发病基础。有研究报道，NAFLD小鼠肝组织miR-27a表达降低，miR-27a过表达可减轻小鼠肝组织TG的含量，从而减轻脂肪肝[3]。Appari 等[4]研究发现，miR-27a通过参与p38MAPK磷酸化而影响其下游基因的表达。水通道蛋白9（AQP9）是肝细胞摄取甘油的特异性通道，研究发现NAFLD大鼠肝细胞中p38MAPK和AQP9蛋白及mRNA表达显著升高，抑制p38MAPK表达及磷酸化可降低AQP9蛋白及mRNA的表达[5]。祛痰活血方是西南医科大学附属中医医院孙同郊教授治疗脂肪肝的经验方，具有活血化瘀、疏肝健脾功效。前期研究发现，祛痰活血方可降低TG、总胆固醇（TC）水平，总有效率达88%[6]。动物实验发现，祛痰活血方可抑制p38MAPK信号通路，减少AQP9的表达，减少TG在肝细胞蓄积，改善NAFLD大鼠肝脏脂肪变性[7]。因此推测miR-27a可能通过调节p38MAPK信号通路影响AQP9的表达，进而影响TG的形成。本实验采用高脂饲料喂养建立NAFLD大鼠模型，观察祛痰活血方对大鼠肝组织miR-27a、p38MAPK及AQP9表达的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物及饲料

清洁级雄性SD大鼠32只，体质量180～200g，成都达硕生物科技有限公司，动物生产许可证号SCXK（川）2020-24，饲养于温度20～24 ℃、相对湿度50%～60%环境。高脂饲料（82%基础饲料＋10%猪油＋2%胆固醇＋5%蛋黄粉＋1%胆盐），成都达硕生物科技有限公司，许可证号SCXK（川）2020-028。

1.2 药物及制备

祛痰活血方（法半夏10g，陈皮10g，茯苓10g，丹参15g，郁金15g，山楂15g，黄芩10g，薏苡仁15g，泽泻15g，柴胡10g，决明子10 g），西南医科大学附属中医医院药剂科提供。将所有饮片混匀，2 500 mL蒸馏水浸泡30 min，煎煮30 min，收集药液，药渣再加1 000 mL蒸馏水煎煮30 min，合并2次药液，浓缩至含原药材2.16 g/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂和仪器

天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、TG、TC、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别为20200827、20200829、20200831、20200831、20200829、20200828；miRNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司，批号分别为RP5901、RP2401；反转录试剂盒、SYBR®Green RT-PCR Master Mix，日本Toyobo公司，批号分别为FSQ-201、QRT-101；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western一抗二抗去除液，上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为P0033-1、P0010S、P0025；AQP9、p38MAPK、p-p38MAPK、GAPDH抗体，英国Abcam公司，货号分别为ab15127、ab170099、ab4822、ab8245；山羊抗兔IgG/HRP抗体，货号bs-0295G-HRP，北京博奥森生物技术有限公司；ECL显影液，美国Thermo Scientific公司，批号35055。全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司，型号IMARK），PCR扩增仪（德国Eppendorf公司，型号6311000070），正置显微镜（日本尼康公司，型号Nikon E200），超净工作台（苏州净化设备有限公司，型号SW-CJ-1G），台式高速冷冻离心机（上海成贯仪器有限公司，型号Eppendorf 5427R），-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Scientific公司，型号Thermo705），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号BIO-RADXR）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

32只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组6只、造模组26只，正常组予普通饲料喂养，造模组予高脂饲料喂养，均自由饮水。造模第8周，随机处死2只造模组大鼠，取肝组织，HE染色确认造模成功[8]。剩余成模大鼠随机分为模型组和祛痰活血方低、中、高剂量组，每组6只。参照人与动物给药剂量换算公式[9]，祛痰活血方低、中、高剂量组按5.4、10.8、21.6 g/kg剂量灌胃给药（相当于成人日用剂量3、6、12倍），1次/d，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，给药体积10 mL/kg。除正常组外，其余各组大鼠继续予高脂饲料喂养，连续4周。

2.2 标本采集

给药4周后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（10 mL/kg）麻醉大鼠，腹部消毒，做U形切口，分离暴露腹主动脉，取血约5 mL，室温静置1 h，1 370×g离心10 min，取上清液，分装待测或-80 ℃保存。大鼠脱颈处死，快速取出肝脏，生理盐水冲洗，吸干水分，称重，取肝左叶浸泡于福尔马林中，常温固定过夜，行HE染色；取肝右外叶约1 cm×1 cm×1 cm组织行油红O染色；余肝组织剪碎，放入冻存管中，-80 ℃冰箱保存。

2.3 肝功能检测

取大鼠血清，全自动生化分析仪检测大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL含量。

2.4 HE染色

将肝左叶用福尔马林固定过夜，石蜡包埋，切片（厚度约5 μm）；二甲苯脱蜡，梯度乙醇（100%、90%、80%、75%）浸泡脱水；苏木素染色，蒸馏水冲洗；伊红染色，蒸馏水冲洗；梯度乙醇（75%、80%、90%、100%）脱水，二甲苯透明，自然晾干，中性树胶封片，显微镜下进行图像采集。

2.5 油红O染色

将肝右外叶用福尔马林固定过夜；10%、20%蔗糖溶液分别浸泡1、5 h，再放入30%蔗糖溶液中4 ℃冷藏过夜；将组织置于液氮中，3～5 s后取出，重复3～4次；OCT包埋盒包埋，-20 ℃冷却；切片（厚约7 μm），置于福尔马林中固定10 min，蒸馏水冲洗；60%异丙醇浸洗30 s；改良油红O染色剂染色10 min；60%异丙醇洗10 s，蒸馏水冲洗；苏木素染色液复染1～2 min，蒸馏水冲洗，自然干燥；甘油明胶封片，显微镜下进行图像采集。

2.6 RT-PCR检测

miRNA提取试剂盒提取肝组织miRNA；总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。将RNA反转录为cDNA，反转录条件：37 ℃、15 min，50 ℃、5 min，98 ℃、5 min。参照SYBR®Green RT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应，反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40个循环。miRNA-27a以U6为内参，其余指标以GAPDH为内参，采用相对定量2-ΔΔCt法进行分析。miR-27a引物序列：F 5’-GC GCGTTCACAGTGGCTAAG-3’，R 5’-AGTGCAGGG TCCGAGGTATT-3’，扩增产物长度142 bp；AQP9引物序列：F 5’-AAGGACGGTGCCAAGAA-3’，R 5’-AT CACGACTGCCGATGC-3’，扩增产物长度197 bp；p38MAPK引物序列：F 5’-GGACCTAAAGCCCAGC AA-3’，R 5’-CAGCCCACGGACCAAATA-3’，扩增产物长度186 bp；U6引物序列：F 5’-CTCGCTTCGGCA GCACATATACTR-3’，R 5’-ACGCTTCACGAATTTG CGTGTC-3’，扩增产物长度168 bp；GAPDH引物序列：F 5’-CC ATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，R 5’-CCT CAAGATT GTCAGCAAT-3’，扩增产物长度141 bp。每组设6个复孔。

2.7 Western blot检测

提取肝组织总蛋白，BCA法测定蛋白含量；等量蛋白上样，电泳；100 V转膜60 min；5%脱脂牛奶封闭90 min；按1∶1 000稀释AQP9、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次5 min；按1∶1 000稀释二抗，室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；滴加ECL显影液，采用凝胶成像系统扫描并测定灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，多组间比较用方差分析，组间比较用Q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 祛痰活血方对模型大鼠肝功能指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明显升高（P＜0.05），HDL水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，祛痰活血方各剂量组大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明显降低（P＜0.05），HDL水平明显升高（P＜0.05），其中祛痰活血方高剂量组作用最明显。结果见表1。

表1 各组大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与祛痰活血方低剂量组比较，△P＜0.05；与祛痰活血方中剂量组比较，▲P＜0.05

组别 只数 AST/（U/L） ALT/（U/L） TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL/（mmol/L） HDL/（mmol/L）正常组 6 96.72± 5.61 38.68±3.60 0.76±0.06 1.50±0.10 0.81±0.08 1.17±0.09 模型组 6 177.61±12.05* 73.63±3.49* 1.58±0.05* 3.81±0.15* 1.72±0.08* 0.47±0.07* 祛痰活血方低剂量组 6 147.99±13.20# 62.35±8.22# 1.23±0.07# 2.92±0.08# 1.21±0.05# 0.85±0.11# 祛痰活血方中剂量组 6 116.69± 3.89# 44.76±7.72# 0.98±0.03# 2.53±0.14# 1.08±0.06# 1.02±0.18# 祛痰活血方高剂量组 6 105.16± 7.70#△▲ 41.31±3.37#△▲ 0.86±0.08#△▲ 1.83±0.15#△▲ 0.94±0.07#△▲ 1.11±0.11#△▲

4.2 HE染色结果

正常组大鼠肝小叶形态正常，肝细胞无明显脂肪变性、肿胀、坏死及增生，且围绕中央静脉呈放射状分布；模型组大鼠肝小叶形态欠完整，肝细胞分布紊乱，且明显变性肿胀及脂肪变性；祛痰活血方各剂量组大鼠病变较模型组明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠肝组织形态（HE染色，×200）

4.3 油红O染色结果

正常组大鼠肝细胞未见明显红色脂滴；模型组大鼠肝细胞脂滴较多，肿胀及脂肪变性明显；祛痰活血方各剂量组大鼠可见散在分布于胞浆的红色脂滴，细胞结构稍紊乱，少许肝细胞脂肪变性，病变程度较模型组减轻。见图2。

图2 各组大鼠肝组织形态（油红O染色，×400）

4.4 祛痰活血方对模型大鼠肝组织miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织miR-27a mRNA表达明显降低，AQP9、p38MAPK mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，祛痰活血方各剂量组大鼠肝组织miR-27a mRNA表达明显升高，AQP9、p38MAPK mRNA表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中，祛痰活血方高剂量组作用最明显（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠肝组织miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表达比较（±s）

表2 各组大鼠肝组织miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与祛痰活血方 低剂量组比较，△P＜0.05；与祛痰活血方中剂量组比较，▲P＜0.05

组别 只数 miR-27a AQP9 p38MAPK 正常组 6 1.002±0.078 1.002±0.080 1.004±0.118 模型组 6 0.480±0.127* 1.779±0.091* 1.589±0.106* 祛痰活血方低剂量组 6 0.576±0.056# 1.594±0.050# 1.314±0.050# 祛痰活血方中剂量组 6 0.778±0.087# 1.311±0.068# 1.212±0.062# 祛痰活血方高剂量组 6 0.967±0.070#△▲ 1.127±0.136#△▲ 1.032±0.114#△▲

4.5 祛痰活血方对模型大鼠肝组织水通道蛋白9和p-p38MAPK蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织AQP9和p-p38MAPK蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，祛痰活血方各剂量组大鼠肝组织AQP9和p-p38MAPK蛋白表达明显降低（P＜0.05），其中，祛痰活血方高剂量组降低最明显。结果见图3、表3。

表3 各组大鼠肝组织AQP9、p-p38MAPK蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠肝组织AQP9、p-p38MAPK蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与祛痰活血 方低剂量组比较，△P＜0.05；与祛痰活血方中剂量组比较，▲P＜0.05

组别 只数 AQP9/GAPDH p-p38MAPK/p38MAPK正常组 6 0.308±0.180 0.254±0.018 模型组 6 0.879±0.091* 0.609±0.106* 祛痰活血方低剂量组 6 0.649±0.058# 0.414±0.050# 祛痰活血方中剂量组 6 0.411±0.098# 0.292±0.072# 祛痰活血方高剂量组 6 0.327±0.132#△▲ 0.275±0.114#△▲

图3 各组大鼠肝组织AQP9、p-p38MAPK蛋白免疫印迹图

5 讨论

根据临床表现，NAFLD属中医学“肝癖”“胁痛”范畴。NAFLD患者多形体肥胖、痰浊内生、血脉瘀滞[10]。孙同郊教授认为痰瘀互结是其基本病机，其病因可概括为过食肥甘厚味，或久卧久坐，体内痰盛，或七情内伤，或先天禀赋异常等，导致脾虚运化无权，肝疏泄失职，水谷精微不能正常输化，水湿内停，痰浊内生，气滞血瘀，湿痰瘀互结于肝而成[11]，多属本虚标实之证，以肝脾肾虚为本，痰浊、气滞血瘀为标。祛痰活血方为二陈汤加减而成，方中柴胡、黄芩疏肝行气燥湿，法半夏燥湿化痰，陈皮行气化痰，茯苓健脾利湿，薏苡仁、泽泻健脾渗湿泄浊，决明子清热解毒，郁金、丹参、山楂活血化瘀，诸药合用，可达理气祛痰、活血化瘀、疏肝健脾之效。

正常情况下脂肪细胞中TG能分解为甘油和脂肪酸，释放入血后在肝细胞内合成TG，并与载脂蛋白、胆固醇等结合形成极低密度脂蛋白，转运到肝外组织储存或加以利用，达到动态平衡。NAFLD的形成与肝脏中TG过度蓄积相关。Zhang等[12]发现，miR-27a过表达可减轻小鼠肝组织TG含量，从而减轻NAFLD。此外，研究显示miR-27a在高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝组织中低表达，而p38MAPK mRNA及蛋白表达升高[13]。课题组前期研究发现，祛痰活血汤能显著减轻NAFLD大鼠肝脏脂肪变性程度，降低肝细胞凋亡指数，调节脂代谢紊乱[14]；祛痰活血方药物血清能抑制NAFLD大鼠原代肝细胞内p38MAPK蛋白的磷酸化，降低AQP9表达，提示p38MAPK信号通路可能是祛痰活血方治疗NAFLD的关键通路之一[7]。本研究结果显示，祛痰活血方可上调NAFLD大鼠肝脏miR-27a的表达，抑制p38MAPK通路激活和下调AQP9表达，减少肝脏中脂肪生成，改善肝功能，进而减轻肝脏脂肪变性。