推拿按法对腰椎间盘突出症大鼠步态及背根神经节 白细胞介素-23及其受体蛋白表达的影响

林坚，江煜，陈水金，陈乐春，陈进城，张幻真，林志刚

1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003； 2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350003

腰椎间盘突出症是由于腰椎间盘退变、纤维环破裂，髓核突出，刺激或压迫神经根、马尾神经而引起腰腿部疼痛的一种疾患，也是临床上发生腰腿疼痛的主要病因，常伴随剧烈、持久的疼痛。推拿广泛应用于腰椎间盘突出症的治疗，具有很好的临床疗效[1]。研究表明，背根神经节的白细胞介素-23（IL-23）及其受体（IL-23R）能诱导初级中枢的外周敏化，从而参与腰椎间盘突出症疼痛的发展和维持过程[2]。本课题组前期研究发现，推拿对腰椎间盘突出症大鼠有很好的镇痛作用[3]，但其作用机制是否与背根神经节IL-23、IL-23R相关尚不明确。本实验拟观察推拿按法对腰椎间盘突出症模型大鼠右后足步态参数的影响，以及对背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达的影响，探讨推拿按法对腰椎间盘突出症的镇痛效应及其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠24只，体质量180～220g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学动物实验中心，室温22 ℃，湿度45%，12 h明暗交替，自由摄食饮水。

1.2 主要仪器与试剂

CatWalk XT型步态分析仪（瑞士Noldus公司），自行研制大鼠推拿操作指套装置（专利号201821318407.9），自行研制大鼠推拿操作固定器（专利号201821139321.X），AVANTI J-15R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司），SLPe-SLPt型超声波细胞破碎仪（美国BRANSON公司），Tetra型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），Gene Pulser Xcell型电转仪（美国Bio-Rad公司），Gel Doc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），Gel Doc EZ型成像及分析软件（美国Bio-Rad公司）。Rabbit anti IL-23（美国Abcam公司，货号ab45420），Rabbit anti IL-23R（美国Abcam公司，货号ab53656），HRP标记山羊抗兔IgG（美国Jackson Immunolab公司，货号09602），免疫组化检测试剂盒（美国CST公司，货号8109）。

1.3 分组及造模

实验大鼠单笼适应性饲养3 d，按随机数字表法分为正常组、模型组、推拿组，每组8只。参照文献[4]制备坐骨神经慢性压迫性损伤（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）模型。模型组和推拿组大鼠麻醉后，固定，备皮，于大鼠右股骨中段后方约1 cm处平行于股骨暴露坐骨神经主干，用4-0铬制羊肠线分3道结扎坐骨神经，每道间隔约1 mm，缝合。模型制备后大鼠出现跛行，足呈轻度外翻状，且有时出现舔舐、悬空等后肢保护现象为造模成功。

1.4 干预

推拿组在CCI造模后第4日开始对右侧腓肠肌“承山”进行按法干预，每日1次，每次10 min，直至造模后第17日结束（共干预14次）。手法干预前需将大鼠置于自行研制的推拿操作固定器5 min，让大鼠适应环境。为规范手法刺激量，操作过程中右手拇指套上自行研制的大鼠推拿操作指套装置，以拇指端置于大鼠右侧腓肠肌“承山”上，以腕关节为支点，掌指部主动施力，做与腓肠肌相垂直的按压。设定手法数据参数为压力40 N、频率60次/min。见图1。正常组及模型组仅予相同抓取与固定。

图1 推拿按法操作和力学参数图

1.5 步态检测

造模前对大鼠进行连续数日的适应性训练，直至无外界刺激情况下所有大鼠能连续3次不停顿且匀速地通过通道[5]。利用CatWalk步态分析仪高速摄像仪捕捉造模前及造模后第1、3、7、10、14、17日大鼠右后足步态参数，通过步态分析仪的Auto-analysis技术，对步态数据进行读取。本实验从最大接触面积、足印面积及摆动时间来评价大鼠的肢体功能情况。

1.6 背根神经节形态观察

步态检测结束后处死所有大鼠，切取大鼠右侧背根神经节，切片，固定，HE染色，光镜下观察大鼠右侧背根神经节形态。

1.7 免疫荧光染色检测背根神经节白细胞介素-23及其受体蛋白表达

取大鼠右侧背根神经节，经染片、冲洗、甲醇破膜、冲洗、驴血清封闭、一抗孵育、冲洗、二抗避光孵育、封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.8 Western blot检测背根神经白细胞介素-23及其受体蛋白表达

取大鼠右侧背根神经节，称重，于冰上加入裂解液（组织∶裂解液为1∶12.5 mg/mL），裂解30 min，超声匀浆，高速离心10 min，取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后冰冷转膜，丽春红染色，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入IL-23、IL-23R一抗孵育过夜，TBST洗膜，加入HRP标记二抗，37 ℃孵育2 h，ECL发光试剂盒显色，使用凝胶成像系统成像，Image Lab软件对蛋白条带进行灰度值分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，对数据进行正态性及方差齐性检验，方差齐用LSD法，方差不齐用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 推拿按法对模型大鼠右后足步态参数的影响

与正常组比较，模型组大鼠右后足最大接触面积、足印面积显著减少，摆动时间明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，推拿组大鼠右后足最大接触面积、足印面积增加，摆动时间减少，第17日差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1～表3。

表1 各组大鼠不同时点右后足最大接触面积比较（±s，mm2）

表1 各组大鼠不同时点右后足最大接触面积比较（±s，mm2）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 造模前 第1日 第3日 第7日 第10日 第14日 第17日 正常组 8 68.2±6.0 64.0±9.2 68.6±10.3 66.7±11.4 74.6±11.8 70.6± 7.6 68.0± 9.4 模型组 8 67.2±6.0 18.0±6.9** 19.2± 6.2** 25.2± 6.2** 28.9±10.4** 32.7± 4.0** 36.0± 1.8** 推拿组 8 61.0±7.5 12.0±9.3 18.3± 7.6 31.0± 8.0 32.6± 7.3 44.7±11.9# 48.6±10.7#

表2 各组大鼠不同时点右后足足印面积比较（±s，mm2）

表2 各组大鼠不同时点右后足足印面积比较（±s，mm2）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 造模前 第1日 第3日 第7日 第10日 第14日 第17日 正常组 8 91.9±7.1 88.5±12.3 94.4±10.3 94.9±13.5 103.3±16.1 94.9± 5.8 88.2± 9.9 模型组 8 91.4±7.8 27.3± 6.7** 24.5±12.2** 42.4± 7.5** 43.8± 7.5** 56.1±11.6** 58.6± 4.5** 推拿组 8 89.7±9.3 24.4±21.5 19.1±11.6 42.6±10.1 51.1± 5.2 57.1±14.8 71.1±14.8#

表3 各组大鼠不同时点右后足摆动时间比较（±s，s）

表3 各组大鼠不同时点右后足摆动时间比较（±s，s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 造模前 第1日 第3日 第7日 第10日 第14日 第17日 正常组 8 0.11±0.015 0.11±0.011 0.11±0.014 0.11±0.009 0.12±0.015 0.11±0.016 0.12±0.015 模型组 8 0.12±0.014 0.36±0.071** 0.30±0.050** 0.20±0.035** 0.20±0.029** 0.21±0.013** 0.19±0.022**推拿组 8 0.12±0.009 0.40±0.133 0.27±0.058 0.20±0.057 0.16±0.047# 0.16±0.030# 0.13±0.040#

2.2 推拿按法对模型大鼠背根神经节形态的影响

正常组大鼠背根神经节细胞形态完整，边界清晰，细胞核完整清晰，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠背根神经节内细胞出现变形、溶解现象，边界不清，细胞质呈深紫色，细胞核偏移，可见炎性细胞浸润；推拿组大鼠背根神经节形态无明显改善。见图2。

2.3 推拿按法对模型大鼠背根神经节白细胞介素-23及其受体蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，推拿组大鼠背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达明显降低（P＜0.05）。结果见图3、图4。

图3 各组大鼠背根神经节IL-23、IL-23R蛋白阳性表达 （免疫荧光染色，×200）

图4 各组大鼠背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达比较（±s，每组8只）

3 讨论

腰椎间盘突出症属中医学“经筋病”范畴。《素问•痿论篇》有“阳明者，五脏六腑之海，主润宗筋，宗筋主束骨而利机关也”，表明经筋有约束骨骼、协助运动的功能。经筋功能失常则表现为肢体疼痛、活动不利等症状，如《素问•长刺节论篇》记载“病在筋，筋挛节痛，不可以行，名为筋痹”，与腰椎间盘突出症临床表现吻合。研究显示，腰椎间盘突出症非手术治疗方法众多，涉及牵引、理疗、手法、药物和针灸等，均有一定的临床疗效[6]。推拿已应用于腰椎间盘突出症的治疗，是目前临床治疗腰椎间盘突出症的主要方法之一[7]。

本实验选择大鼠作为研究对象，因其身体较小，故选择按法为干预手法。本实验选择“承山”进行干预，承山是临床治疗腰椎间盘突出症的要穴，且此处肌肉较为丰满，便于进行推拿手法的操作。

由于动物无法言表疼痛情况，因此评估疼痛程度常通过考察动物行为学的变化。CatWalk步态分析系统利用脚印光亮折射技术，通过高速摄像机捕获动物的足迹，能客观地检测动物步态行为[8]。有文献报道，足印面积、最大接触面积及摆动时间等步态指标与疼痛相关[9]。因此，本研究通过CatWalk步态分析系统采集分析上述步态指标，评估推拿手法对腰椎间盘突出症模型大鼠步态的影响，更客观、更精确地评价推拿手法对腰椎间盘突出症的疗效。本研究结果显示，推拿按法能改善腰椎间盘突出症模型大鼠步态行为，表明推拿手法对腰椎间盘突出症模型大鼠的运动功能起到积极作用。

目前认为，外周敏化和中枢敏化是腰椎间盘突出症疼痛的主要机制，外周敏化是指周围神经系统对伤害刺激敏感性增强。研究证实，抑制初级感觉神经元的外周敏化能减轻疼痛[10]。IL-23是背根神经节内重要的炎症因子。Jana等[11]研究发现，IL-23能通过p-38MAPK信号通路介导疼痛。同时，IL-23能诱导背根神经节产生IL-17、IL-6、脑源性神经营养因子及一氧化氮合酶等炎症因子，从而强化疼痛信号通路[12]。研究表明，IL-23/IL-23R是一条重要的信号轴，能强化NMDANR1的磷酸化，引起背根神经节产生外周敏化，在许多疾病中起重要作用[13]。本研究结果显示，CCI造模后大鼠背根神经节IL-23及IL-23R蛋白表达均显著升高，参与疼痛的产生和维持，该结果与上述研究类似。经推拿按法干预后，背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达明显降低，表明推拿按法对腰椎间盘突出症模型大鼠背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达有抑制作用。

综上，推拿按法能改善腰椎间盘突出症模型大鼠右后足最大接触面积、足印面积及摆动时间等步态指标，抑制背根神经节IL-23、IL-23R蛋白表达，通过调控周围神经系统的外周敏化达到镇痛作用，这可能是推拿按法治疗腰椎间盘突出症的分子机制之一。