神经纤毛蛋白1在卵巢癌组织标本中的表达及临床意义

李婧 ，崔自明 ，陈雅卓 ，张燕*

（1西安交通大学第一附属医院转化医学中心，西安710061；2解放军总医院光明桥门诊部，北京100061)）

卵巢癌是女性生殖系统最常见的肿瘤之一，也是恶性程度和致死率最高的妇科肿瘤[1]。卵巢癌患者发病早期因缺乏特异性症状和体征，导致卵巢早期诊断非常困难，70%的卵巢癌患者确诊时已属晚期[2]。尽管目前临床上针对卵巢癌的外科手术和药物治疗已相对成熟，但卵巢癌患者的五年生存率仅为30%，治疗和预后效果极差，严重影响女性的健康和生命[3,4]。

目前临床上卵巢癌的独立预后指标主要包括FIGO分期、病理类型、肿瘤分化程度、是否有腹腔转移/淋巴结转移等临床特征，除此之外，卵巢癌相关基因，即卵巢癌肿瘤标志物的表达在卵巢癌预后判断中的价值也日益受到人们重视[5,6]。血清CA125是卵巢癌的经典肿瘤标志物，由于CA125在其他多种良性疾病患者血清中往往也呈现高表达状态，作为卵巢癌肿瘤标志物的特异性不足，因此目前临床上CA125主要用于评价治疗效果和检测复发。目前，对卵巢癌的肿瘤标志物进行了大量研究，但仍缺乏有效且特异性的肿瘤标志物候选分子[7]。

神经纤毛蛋白1（neuropilin 1, NRP1）是一种单次跨膜糖蛋白，起初在非洲爪蟾神经系统中被发现[8]。NRP1蛋白通过识别其配体神经轴突蛋白3（semaphorins 3, Sema 3）家族和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）家族[9]，在神经调节、免疫调节、肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要功能[10-12]。本研究分析了NRP1表达与卵巢癌患者病理分型、临床分期等病理特征的相关性，以期通过检测NRP1表达为临床上卵巢癌的治疗和干预方案提供指导。

材料与方法

1 材料

卵巢癌细胞系SKOV3为本实验室保存。收集我院2013年至2019年120例卵巢癌组织标本，均经病理切片证实为卵巢癌，其中64例浆液性腺癌，15例粘液性腺癌，10例子宫内膜样腺癌，10例透明细胞癌，21例生殖细胞肿瘤/间质细胞肿瘤等其他类型卵巢癌。纳入标准为：①术后经病理科确诊为卵巢癌；②术前未接受化放疗；③无其他癌症、盆腔炎症及卵巢相关疾病病史。收集患者的年龄、组织学类型、分化程度、分期、肿瘤转移等临床资料。大部分卵巢癌患者行手术时已属晚期，仅收取到配对的癌旁组织23例。病理分化程度按WHO 病理分化标准，临床分期按2014年FIGO指南。上述标本均为常规石蜡包埋的存档蜡块。另收集4例手术切除的新鲜卵巢癌组织及配对癌旁组织标本。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibico公司；兔抗人NRP1单克隆抗体购自美国Abcam公司；生物素标记山羊抗兔IgG二抗、生物素-链霉卵白素免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司；Fast 200 RNA提取试剂盒购自上海飞捷公司；反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒均购自日本TAKARA公司。

2 细胞培养

从液氮罐中取出SKOV3卵巢癌细胞冻存管，迅速置于37℃水浴中，轻柔摇晃使其尽快融化，转移细胞悬液至离心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，轻柔混匀后1000r/min低速离心5min，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，混合均匀后转移至培养皿中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，24h后更换新鲜培养基，随后每隔2d传代1次。

3 免疫荧光

SKOV3卵巢癌细胞用4%多聚甲醛固定，加入0.1% Triton X-100透化5min；加入10%山羊血清室温封闭20min，PBS漂洗后加入一抗4°C孵育过夜，加入TRITC标记的抗兔二抗，室温孵育1h；加入细胞核染料 (4’, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)，室温孵育5min，荧光显微镜下观察。

4 mRNA实时定量PCR分析

组织充分研磨后，利用RNA提取试剂盒提取组织总RNA，定量后取2μg RNA进行反转录。cDNA样本稀释后用实时荧光定量试剂盒检测NRP1 mRNA水平。目的基因NRP1引物序列：5’-AGGACCATACAGGAGATGGC-3’，5’-AATAGACCACAGGGCTCACC-3’；内参基因GAPDH引物序列：5’-TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，5’-CAGGCGCCCAATACGACCAAATC-3’。使用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪、TAKARA SYBR Premix Ex Taq II（DRR820A）试剂进行荧光定量PCR扩增。PCR反应体系为25μl，含12.5μl SYBR PCR缓冲液，上下游引物各1μl（引物浓度10μmol/L)。PCR反应条件为：95℃ 30s，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40 个循环。扩增完成后采用2-△△CT法进行实验数据分析。

5 蛋白免疫印迹分析

组织充分研磨后加入RIPA细胞裂解液（1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，0.15mol/L NaCl，50mmol/L Tris pH7.4，2mmol/L焦磷酸钠，25mmol/L β-甘油磷酸脂，1mmol/L EDTA，1mmol/L Na3VO4，0.5μg/ml亮抑酶肽），RIPA裂解液在使用前，按1:100的稀释比例加入100×蛋白酶抑制剂Cocktail与100×磷酸酶抑制剂Cocktail混匀。冰上裂解30min，期间涡旋振荡3～5次。4℃条件下12000r/min离心20 min，吸取上清液，测定蛋白浓度后，按照相应比例加入5×上样缓冲液，充分混匀并100℃ 10min。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，电转移到PVDF膜上。转膜后，用5%脱脂奶缓冲液封闭PVDF膜1h，分别加入稀释的NRP1抗体、actin内参抗体，4℃过夜。TBST洗膜液洗膜5次，辣根过氧化酶标记的兔二抗室温孵育1h，TBST洗膜液洗膜5次。ECL发光，显色后显影、定影。曝光后 X光片用Quantity One软件进行分析。

6 免疫组织化学染色

卵巢癌组织标本切片65℃烤片1h，分别置于二甲苯溶液 I、II 中15min脱蜡。取出切片，置于梯度乙醇中水化。微波法枸橼酸钠抗原修复15min后加入内源性过氧化物酶阻断剂孵育10min。自然冷却至室温，加入山羊血清工作液室温封闭30min。加入一抗4℃孵育过夜。次日加入生物素化二抗室温孵育30min。加入辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30min。显微镜下DAB显色30s，自来水充分冲洗。苏木精复染后进行透明，脱水，封片。免疫组织化学染色图像分析由两位独立研究者评估。

7 统计学处理

所有研究数据使用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结 果

1 卵巢癌细胞系表达NRP1

处于生长对数期的SKOV3卵巢癌细胞经4%多聚甲醛固定后，进行免疫荧光检测显示： NRP1在SKOV3卵巢癌细胞中呈强阳性表达，主要定位于细胞质和细胞膜（图1）。由此提示，NRP1可能在卵巢癌组织中高表达。

图1 NRP1蛋白在SKOV3卵巢癌细胞中的表达情况。比例尺，10μmFig.1 Expression of NRP1 protein in SKOV3 ovarian cancer cells. Scale bar, 10μm

2 卵巢癌组织高水平表达NRP1

对4例新鲜卵巢癌组织和配对癌旁组织进行实时定量PCR和Western blot检测显示：在癌旁组织中几乎不表达或低水平表达NRP1 mRNA和蛋白，而卵巢癌组织中NRP1 mRNA和蛋白水平显著高于癌旁组织（图2、3）。

3 卵巢癌组织中NRP1水平与其低分化程度、淋巴结转移和血清CA125水平呈正相关

对120例卵巢癌组织标本和23例配对癌旁组织标本进行NRP1免疫组织化学染色显示：NRP1在癌旁组织中不表达或仅呈弱阳性表达，但在卵巢癌组织中其免疫反应性明显增强，包括浆液性腺癌、粘液性腺癌和子宫内膜样腺癌。NRP1阳性反应产物主要位于卵巢癌细胞胞质和细胞膜 (图4)。

图2 卵巢癌组织中NRP1 mRNA 的表达。PC：癌旁组织；T：卵巢癌组织；1#、2#、3#、4#：1 号、2 号、3 号、4 号卵巢癌患者Fig.2 Expression of NRP1 mRNA in ovarian cancer tissues. PC: paracancerous tissue; T: tumor tissue; 1#, 2#, 3#, 4#: number 1, 2, 3, 4 ovarian cancer patient

图3 卵巢癌组织中NRP1蛋白水平检测。A，代表性免疫印迹分析结果；B，免疫印迹分析结果的定量分析；PC，癌旁组织；T，卵巢癌组织；1#、2#、3#、4#，1号、2号、3号、4号卵巢癌患者。**，P＜0. 01Fig.3 Expression of NRP1 protein in SKOV3 ovarian cancer tissues. A, representative Western blotting images; B, quantification and statistical analysis of Western blotting results. PC: paracancerous tissue; T: tumor tissue; 1#, 2#, 3#, 4#: number 1, 2, 3, 4 ovarian cancer patient. **, P＜0. 01

图4 卵巢癌组织中NRP1 水平的免疫组织化学检测。比例尺，50μmFig. 4 Immunohistochemical examination of NRP1 level in ovarian cancer tissues. Scale bar, 50μm

120例卵巢癌组织中，NRP1阳性表达率为76.67%（92/120），显著高于配对癌旁组织NRP1阳性表达率47.83%（11/23）（表1）。

表1 卵巢癌和癌旁组织中NRP1阳性率比较Tab. 1 Comparison of the positive rates of NRP1 in ovarian cancer and paracancerous tissues

120例卵巢癌组织标本中，有30例处于G1分化期， 29例处于G2分化期，61例处于G3分化期。根据FIGO分期又可将该120例卵巢癌组织标本分为41例I/II分期卵巢癌组织和79例III/IV分期卵巢癌组织。120例卵巢癌患者中，有73例存在淋巴结转移，78例血清CA125水平在500IU/L以上。对NRP1表达与临床病理特征之间关系分析发现（表2）：NRP1阳性率与患者年龄、癌肿大小及组织类型均无明显相关性。处于G2、G3分化期的卵巢癌组织标本NRP1阳性率分别为75.86%和85.25%，处于G1分化期的卵巢癌组织NRP1阳性率为60%；处于III/IV FIGO分期的卵巢癌组织标本NRP1阳性率为83.54%，处于I/II FIGO分期的NRP1阳性率为63.41%，表明NRP1阳性表达率与卵巢癌的低分化程度呈正相关。发生淋巴结转移的卵巢组织的NRP1阳性率为84.93%，明显高于无淋巴结转移的卵巢癌组织NRP1阳性率63.83%。高血清CA125水平分组的患者，其卵巢癌组织的NRP1阳性率为85.9%，低血清CA125水平的患者，其卵巢癌组织标本的NRP1阳性率为59.52%，即二NRP1阳性表达率与卵巢癌者血清CA125水平呈正相关。

表2 120例卵巢癌组织中NRP1免疫反应性与临床病理特征的关系Tab. 2 NRP1 immunoreactivities in 120 cases of ovarian cancer tissues and its correlation with clinical pathological features

讨 论

卵巢癌由于其确诊难、转移率高、化疗耐药等原因，成为死亡率最高的妇科恶性肿瘤[13]。近年来，随着新型化疗方案、支持治疗、肿瘤细胞减灭术等新治疗方式的不断发展，卵巢癌患者的平均生存时间得到有效延长，但晚期卵巢癌患者的治疗效果仍然不尽人意[14,15]。因此，探寻新的特异性卵巢癌标志物，能够为早期诊断、手术切除癌灶、化疗方案选择、提高化疗有效率提供帮助，进一步延长患者生存时间。

NRP1是由位于10p11.22的Nrp1基因编码的一种大小为120～140kDa的Ⅰ型跨膜蛋白[16]。NRP1能够结合许多配体和共同受体，广泛参与人体的生理和病理过程，在免疫调节、心血管疾病发展、神经元引导、血管生成等方面发挥重要作用[11,17,18]。小鼠模型研究表明，NRP1是心脏、肾、眼和后肢发育中动脉生长的关键性调节因子，可促进动脉发生[19]。近年来，关于NRP1在肿瘤上的研究越来越多，其过表达与肿瘤侵袭性、病理分期和预后不良有关。许多研究表明NRP1在肝癌、肺癌、肾癌中呈现高表达状态[20-23]。

本研究中，我们采用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹分析技术、免疫组织化学染色技术研究了NRP1在卵巢癌组织标本及癌旁组织中的免疫反应性，比较了两种组织中NRP1免疫反应性的差异，发现NRP1在卵巢癌组织标本中的阳性率明显高于癌旁组织。分析NRP1免疫反应性与卵巢癌标本临床病理特征关系发现，分化期越后、FIGO分期越晚、血清CA125水平越高的卵巢癌标本的NRP1免疫反应性越强，发生淋巴结转移的卵巢癌标本中NRP1免疫反应性越强。NRP1蛋白表达可能影响卵巢癌的病理分级，使其向III/IV期发展，还能加剧癌细胞的分化程度，促进淋巴结转移，从而综合影响患者的预后情况。本研究提示检测NRP1免疫反应性可为卵巢癌患者预后、指导卵巢癌的治疗和干预提供指导。