琯溪蜜柚幼果中柚皮苷含量变化规律

胡 阳，晏 幸，伍 菱，李利君，杨远帆，杜希萍，翁淑燚，倪 辉,*，李清彪

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021；4.大闽食品（漳州）有限公司，福建 漳州 363000）

柚皮苷是一种黄烷酮糖苷类物质，在柚、酸橙等柑橘水果中含量丰富，可占黄酮总质量分数的75%以上[1]。较多的研究工作已经揭示，柚皮苷等黄酮类化合物具有强大的抗氧化和清除自由基的能力，还可以调节Ras/Raf/Erk信号通路[2]，因此在医药工业上，柚皮苷可用于生产防治心脑血管疾病、抗癌、抗病毒、降脂、降血糖、镇痛、清热及消炎等药物[3]。在食品工业上，柚皮苷既可作为天然色素、风味改良剂和苦味剂用于食品、饮料的生产[4-5]，又可经羟醛综合反应得到查耳酮中间体后，再进一步催化加氢而制得新型甜味剂柚皮苷二氢查耳酮和新橙皮苷二氢查耳酮。这两种甜味剂不仅甜度高，分别为蔗糖的500～700 倍和1 500～1 800 倍，而且甜味持久而且安全性高，是新一代无毒、低能量、防龋齿的高甜度的甜味剂[6-7]。此外，柚皮苷还能用于制备多种高附加值的有机物如鼠李糖、柠檬素、酸性偶氮染料以及具有更高生物活性和药用价值的半合成黄酮类化合物，具有良好的工业应用价值[8]。

柚皮苷提取方式主要包括：水提法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法、酶辅助提取法等[9]。目前，柚皮苷提取的原料主要是柑橘水果加工剩余的皮渣及残次烂果等。除成熟的柑橘类果实外，相关研究表明柑橘幼果中也含有一定量的柚皮苷，且幼果中的柚皮苷含量通常高于成熟的果实。刘春荣等[10]研究表明常山胡柚小青果柚皮苷含量为24.95 mg/g；李则灵等[11]在用丰都红心柚落果制备柚皮素的过程中，发现早期落果的柚皮苷含量比成熟期的含量大。近年来，研究证实柚类水果中柚皮苷等黄酮类化合物的合成高峰期处于未成熟的果期，随着果实的成熟含量显著下降[12]。由于柑橘水果生产管理过程中，人们常摘除20%～30%左右过密幼果（疏果管理），从而保障果实不会因过密而引起养分供给不足[13]。根据以上研究判断，柑橘类的幼果不仅柚皮苷含量比成熟果实高，而且具有一定的产量，因此，其可能是一种潜在的柚皮苷提取原料。

李秀娟[14]研究了中国特有柑橘属植物果实主要黄烷酮含量及其动态变化，结果表明沙田柚果皮在幼果期的柚皮苷含量为75.21 mg/g，宜昌橙果皮在幼果期的柚皮苷含量为30.89 mg/g，爪畦柠檬果皮在幼果期的柚皮苷含量为0.52 mg/g，马蜂柑果皮在幼果期的柚皮苷含量为1.25 mg/g。林励等[15]研究了不同产地土壤橘红的柚皮苷含量，发现产地表土层Ca丰度对柚皮苷含量有显著影响。韩寒冰等[16]对化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化，发现了化橘红果龄15～60 d时，柚皮苷质量分数从52.5%降到了16.1%；田静等[17]研究了化州柚不同发育期柚皮苷的含量变化，发现果皮和果肉中的柚皮苷含量均随着果径的增大而降低；刘佳等[18]对不同果期梅州沙田柚的柚皮苷进行测定，结果显示5月初采摘的沙田柚未成熟果实柚皮苷质量分数最高，达20.68%。以上研究表明，柑橘品种（柚类幼果柚皮苷含量最高）、种植地、发育期对幼果柚皮苷含量具有显著影响。

琯溪蜜柚（Citrus maxima(Burm.) Merr.）原产于福建省平和县，以其肉质地柔软，汁多化渣，口感酸甜适中等优良品质而享誉海内外，是中国特有的优良柚类品种[19-20]。目前，琯溪蜜柚种植面积达4.33万 hm2，年产量达120多万 t[21]，按照20%～30%的疏果量估算，琯溪蜜柚每年疏果量大约20万～35万 t。本实验利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定柚皮苷含量，分析研究种植地海拔、果实部位、果期、贮藏时间及干燥加工等对琯溪蜜柚幼果中柚皮苷含量的影响规律，旨在为利用琯溪蜜柚幼果提取柚皮苷提供含量变化方面的基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

琯溪蜜柚采于福建省平和县，其果实的生长成熟期如图1所示，幼果期主要为4—5月份。乙腈、甲醇（色谱纯）、柚皮苷标准品 美国Sigma公司；无水乙醇（分析纯） 上海沃凯生物技术有限公司；所有用水均为纯水机制备的超纯水（电导率18.2 MΩ·cm）。

图1 琯溪蜜柚生长的不同果期Fig.1 Photographs of Guanxi pomelo fruit at different growth stages

1.2 仪器与设备

JP-500C型高速粉碎机 永康市久品工贸有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；BS 124 S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ5200DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SHB-III型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DHG-9146烘箱 上海精宏实验设备有限公司；UliMate 3000 HPLC仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚皮苷分析方法的建立

参考实验室前期测定蜜柚中柚皮苷含量的方法[22]，选取新鲜蜜柚幼果粉碎，加入体积分数70%乙醇溶液进行超声辅助提取黄酮，提取条件为料液比1∶30（g/mL）、提取时间50 min、提取温度35 ℃、功率200 W，超声结束后真空抽滤，定容。取10 mL定容后的提取液，旋蒸至干，再加入10 mL甲醇并利用超声波辅助溶解，过0.22 µm滤膜进行HPLC分析。采用UliMate 3000 HPLC仪，色谱柱为AlltimaTMC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；进样体积为10 μL；流动相流速为0.4 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为283 nm；溶剂体系由超纯水（流动相A）和乙腈（流动相B）组成。梯度洗脱条件为：0～5 min，95% A、5% B；5～10 min，95%～75% A、5%～25% B；10～35 min，75%～55% A、25%～45% B；35～40 min，55%～95% A、45%～5% B。

HPLC测定柚皮苷的数据利用外标法定量分析，根据柚皮苷标准曲线方程（Y=29 022X－522 173），按下式计算柚皮苷质量分数：

式中：c为从标准曲线上得到被测组分溶液的质量浓度/（μg/mL）；V1为提取液旋干的样品溶液体积/mL；V2为旋干样品复溶后的定容体积/mL；m为样品溶液所代表试样的质量/g。

1.3.2 幼果发育期和种植海拔高度对幼果柚皮苷质量分数的影响

选取如表1所示4 个发育期（幼果I、II、III和IV期）的琯溪蜜柚幼果，分别种植于海拔高度40 m（福建省漳州市平和县小溪镇）和海拔高度668 m（福建省漳州市平和县霞寨镇）2 个地区，该区域均为“琯溪蜜柚之乡”平和县蜜柚种植示范基地，属亚热带季风气候。选取的果实用液氮碾碎进行超声提取，超声提取条件为：超声溶剂70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取时间50 min、提取温度35 ℃、功率200 W，超声提取液经过处理后进行HPLC检测分析。

表1 琯溪蜜柚不同发育期幼果的外观形状及大小Table 1Appearance, shape and size of young Guanxi pomelo fruit at different development stages

1.3.3 幼果表皮及内部白囊柚皮苷质量分数随果实发育期的变化

选取高海拔地区（668 m）种植的琯溪蜜柚不同生长期幼果，将表皮和内部白囊分离，液氮碾碎进行超声提取，超声提取条件为：超声溶剂70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取时间50 min、提取温度35 ℃、功率200 W，超声提取后进行HPLC检测分析。

1.3.4 贮藏时间对幼果柚皮苷质量分数的影响

选取高海拔地区（668 m）种植的I期琯溪蜜柚幼果进行常温贮藏，每隔2 d取样1 次，随着贮藏时间的延长，表皮逐渐变为黄色，根据肉眼观察果皮变黄程度估算着黄比例进行分类（图2）。将不同贮藏程度的幼果表皮和内部白囊分离，液氮碾碎后超声提取，超声提取条件为：超声溶剂70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取时间50 min、提取温度35 ℃、功率200 W，超声提取后进行HPLC检测分析。

图2 不同贮藏期幼果颜色变化Fig.2 Color changes of young pomelo fruit at different storage stages

1.3.5 干燥处理对幼果中柚皮苷质量分数的影响

选取高海拔地区（668 m）种植不同生长期的幼果，将绿色表皮和内部白囊分离，在热风温度90 ℃、热风风速0.6 m/s条件下进行热风干燥处理至材料恒质量，再将干燥后的材料粉碎进行超声提取，超声提取条件为：超声溶剂70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取时间50 min、提取温度35 ℃、功率200 W，超声提取液进行HPLC检测分析。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 幼果中柚皮苷的HPLC分析

根据文献[23]对蜜柚果实各组织分类方式，取各部位蜜柚幼果的超声提取液进行HPLC分析检测，发现样品中有一个大峰而其他的都是小峰，如图3所示，将大峰与柚皮苷标准品的保留时间进行对比，在0.05 s的时间误差内，大峰与柚皮苷标准品完全对应，因此可以判断此物质为柚皮苷。用柚皮苷标准品进行外标法定量分析，本研究标准曲线柚皮苷标准曲线方程Y=29 022X－522 173（X为柚皮苷质量浓度（μg/mL）；Y为峰面积），R2=0.999。该R2符合相关标准曲线的要求，并与刘文静等[24]用HPLC法分析柑橘属果实中类黄酮成分的标准曲线相似，表明本研究柚皮苷浓度与峰面积标准曲线在本测试的线性范围内是可靠的。

图3 蜜柚幼果柚皮苷和柚皮苷标准品的HPLC图Fig.3 Liquid chromatograms of naringin standard and naringin in pomelo fruit

2.2 幼果发育期和种植海拔高度对幼果柚皮苷质量分数的影响

柑橘类水果中柚皮苷合成途径[25-26]如图4所示。柑橘水果中柚皮苷等黄酮类化合物的合成高峰期处于未成熟的果期，随着果实的成熟含量显著下降[12]。由于不同种植海拔受到的光照时间及强度不同，可能会影响柚皮苷的含量。分别选取不同发育期和种植海拔高度（海拔落差约600 m）蜜柚幼果，将整个果实处理后进行柚皮苷含量的检测，结果如图5所示。高海拔地区（668 m）种植的I、II、III和IV期幼果柚皮苷质量分数分别为23.25%、15.54%、13.63%和11.46%，低海拔地区（40 m）种植的I、II、III和IV期幼果柚皮苷分别为13.67%、11.27%、7.59%和6.03%。该结果显示，琯溪蜜柚幼果柚皮苷质量分数随发育期的增长逐渐下降；该现象与相关研究报道总黄酮浓度随蜜柚长大而降低[24]的结论一致，其原因与果实组织中与查尔酮合酶和查尔酮异构酶基因表达的下调有关[25-26]。此外，相同发育期的幼果，高海拔地区（668 m）种植的果实柚皮苷质量分数远大于低海拔地区（40 m）；这些规律与相关研究在其他柑橘水果中发现的规律相似[12,27-28]；其原因是高海拔地区紫外线辐射较强，可诱导促进植物体内的苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶等黄酮合成酶的活性和基因表达水平升高[27-28]，从而促进黄酮类化合物积累，以减少紫外辐射对自身的伤害[29]。

图4 柑橘水果中黄酮类物质代谢途径Fig.4 Metabolic pathways of flavonoids in citrus fruits

图5 幼果发育期和种植海拔高度对幼果柚皮苷质量分数的影响Fig.5 Effects of growth period and planting altitude on naringin content in young pomelo fruit

2.3 幼果表皮及内部白囊柚皮苷质量分数随果实发育期的变化

幼果果实的果肉尚未发育，主要由果皮的绿色皮层和白色囊衣组成，表皮呈现绿色，含有叶绿素，容易同柚皮苷一起提取出来造成柚皮苷提取率下降，影响产品纯度及色泽。如果把表皮去除，可能会引起柚皮苷大量损失。分别对来自高海拔地区（668 m）的不同发育期幼果表皮和内部白囊进行柚皮苷质量分数检测，结果如图6所示。在幼果期I，柚皮苷质量分数最高，且内部白囊中柚皮苷质量分数与表皮中柚皮苷质量分数的差值最大。随着果实的生长发育，绿色表皮和内部白囊的柚皮苷质量分数均呈显著下降趋势，其中绿色表皮和内部白囊的柚皮苷质量分数的差值不断缩小。到幼果期IV时，白色内部白囊的柚皮苷质量分数首次低于绿色柚皮。造成这个结果的原因是鼠李糖基转移酶在柚子幼果期中虽有表达，但随着果实发育时间的延长，鼠李糖基转移酶降低表达，从而使柚皮苷含量逐渐下降[30]。幼果期I柚皮苷质量分数最高，这一时期的果实最适宜用作提取柚皮苷的原料，此外，内部白囊质量分数为22.95%，其明显高于表皮质量分数18.78%，为避免表皮中的色素对产品品质的影响，建议去除绿色表皮层，相对于其他幼果期，此时去除表皮对提取率的影响最小。

图6 不同幼果期幼果表皮及内部白囊的柚皮苷质量分数Fig.6 Naringin contents of young pomelo fruit at different growth stages

2.4 幼果贮藏过程中（表皮由绿变黄）柚皮苷质量分数的变化

相关研究表明，贮藏对柑橘类果实中柚皮苷质量分数具有影响，熊兰兰[31]研究发现红绵柚、白肉柚和红肉柚成熟果肉中柚皮苷质量分数随着贮藏天数增多而降低。庄满贤等[32]研究发现毛橘红柚皮苷含量随着贮存时间的延长而升高。本研究发现，随着贮藏时间延长，果皮颜色由绿色变为黄色，对变黄程度分别为0%、20%、50%、80%和100%的幼果（图2）进行柚皮苷质量分数测定，结果如图7所示。在果皮从0%到100%变黄的过程中，柚皮苷质量分数不断提高，变黄率100%时，表皮和内部白囊的柚皮苷质量分数都达到最大，分别是28.33%和26.48%。产生该结果的原因可能是幼果中的某些初级代谢产物在贮藏过程中转化形成黄酮类次生代谢产物。因此，在利用琯溪蜜柚幼果提取柚皮时，将果实贮藏至全部黄色时进行柚皮苷提取，柚皮苷的提取得率将最大。该结果不同于Shamloo等[33]报道的成熟蜜柚的果肉中柚皮苷等黄酮物质质量分数随着贮藏时间延长而减少，其原因可能是蜜柚成熟期不同，但与庄满贤等[32]研究毛橘红柚皮苷随贮藏时间变化结果相似。

图7 不同贮藏期幼果柚皮苷质量分数的变化Fig.7 Changes in naringin contents in young pomelo fruit at different storage stages

2.5 干燥处理对幼果中柚皮苷质量分数的影响

Farahmandfar等[34]发现对水果和蔬菜进行贮存、加工，尤其是加热会导致黄酮类成分显著损失。琯溪蜜柚的疏果时间非常短，为避免幼果原料变质腐烂，需要将原料进行妥善保存。干燥是食品保存的常用手段之一，Ledesma-Escobar等[35]发现，干燥过程中黄酮类化合物可能会被其他酶（如氧化酶）氧化或者降解，导致黄酮类化合物质量分数降低。如图8所示，不同的幼果期果实，表皮干燥后柚皮苷质量分数从18.78%、11.98%、10.31%、9.46%分别下降至11.68%、8.59%、8.38%、6.64%；白囊干燥后柚皮苷质量分数从22.95%、15.54%、13.63%、8.29%分别下降至15.22%、11.94%、10.41%、5.76%，表明干燥工艺对柚皮苷质量分数有显著影响。黄酮类化合物主要存在于蜜柚果皮细胞内的液泡中[36]，干燥会使果皮细胞结构破坏，导致柚皮苷的释放，从而增加了柚皮苷与酶的接触[37]，更容易造成柚皮苷的降解。因此，在原料没有过剩的情况下不宜对果实原料进行干燥，干燥处理应进一步优化干燥方式与干燥参数，选择最优干燥工艺。

图8 蜜柚幼果表皮和白囊干燥处理前后的柚皮苷质量分数Fig.8 Naringin contents in the epidermis and albedo of young pomelo fruit before and after drying

3 结 论

本实验发现种植地海拔、果实发育期、果实部位、贮藏时间及干燥等因素对琯溪蜜柚幼果柚皮苷质量分数具有显著影响；其中，高海拔地区（668 m）种植的琯溪蜜柚幼果中柚皮苷质量分数高于低海拔地区（40 m）；随着发育期的增长，柚皮苷质量分数不断下降，且内部白囊与绿色表皮中柚皮苷质量分数的差值不断缩小；同一时期采摘的幼果经贮藏后，果实由绿变黄的过程中柚皮苷质量分数不断升高；加热干燥处理会显著降低新鲜幼果表皮及内部白囊柚皮苷质量分数。本实验阐明种植地海拔、果实发育期、果实部位、贮藏时间及加热干燥对琯溪蜜柚幼果中柚皮苷质量分数的影响，为琯溪蜜柚幼果作为柚皮苷提取原料提供参考。