加工工艺对酱牛肉中蛋白质降解及风味物质的影响

吴倩蓉，朱 宁,*，陈 松，周慧敏，李 素，赵 冰，刘 梦，潘晓倩，张顺亮，乔晓玲

（1.中国肉类食品综合研究中心，北京食品科学研究院，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068；2.河南双汇投资发展股份有限公司，河南 漯河 462000）

酱牛肉是我国传统酱卤肉制品之一，已有上千年的历史，产品肉质鲜嫩，香味浓郁，营养丰富，高蛋白低脂肪，同时富含维生素和矿物质[1-2]，深受消费者喜爱。酱牛肉风味是影响消费者选择的重要因素之一，酱牛肉加工过程中，蛋白质和脂质的降解、氨基酸的Strecker降解、氨基酸与还原糖之间的Maillard反应、香辛料及辅料等的复杂反应，共同形成和影响酱牛肉的风味[3-4]，蛋白质降解对挥发性风味物质的形成具有很重要的作用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是目前使用较广泛的一种蛋白质分离鉴定方法，主要依据蛋白质的分子质量进行分离，具有操作简单、分辨率高、结果直观等优点[5-8]，能够较为直观地反映蛋白降解程度。顶空固相微萃取是常见的样品前处理方法之一，对挥发性风味物质进行富集，具有快速、无损、无溶剂等优点[9]，与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用，被广泛运用于分析各种食品的风味[10-13]。在酱牛肉的加工过程中，对成品的二次杀菌是十分必要的，二次杀菌能够延长产品货架期[14]，过低的杀菌温度不能有效杀灭致病菌，但过高的杀菌温度对肉制品的口感、质地、风味以及营养等都有很大的影响，对于传统肉制品而言，确定一个合适的杀菌温度，在确保产品安全的基础上保证其风味及营养等品质是十分必要的。

近年来，国内外学者针对酱牛肉的研究较多，Legako等[15]研究了不同等级原料及加工方式对牛肉品质的影响；高欣等[16]研究了包装材料对牛肉品质的影响；付丽等[14]研究了不同杀菌条件对酱牛肉品质的影响；也有学者对加工过程、加工方式、加水量、盐水注射率等对酱牛肉品质及挥发性风味物质的影响进行了研究[17-20]。但目前对加工过程以及杀菌温度对传统酱牛肉制品蛋白降解及风味变化影响的研究相对较少。本研究对加工过程及不同杀菌温度酱牛肉（原料肉，滚揉、煮制、90 ℃、105 ℃、110 ℃、120 ℃杀菌样品）中蛋白质量浓度、氮含量、蛋白粒径、蛋白表面疏水性进行测定分析，并进行SDS-PAGE分析，同时采用HS-SPME结合GC-MS技术对挥发性风味物质进行检测分析，以期确定对风味物质影响最小的杀菌温度及样品蛋白降解、挥发性风味物质变化规律，为传统酱牛肉的工业化以及风味调控以及进一步研究蛋白降解与风味形成机制的关系提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱牛肉 北京月盛斋清真食品有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、溴酚蓝、1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液、彩虹245广谱蛋白Marker、30%丙烯酰胺混合液 北京索莱宝科技有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、SDS、三氯乙酸、浓硫酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；高效凯氏定氮催化剂片 北京金元兴科科技有限公司；1-苯氨基萘-8-磺酸铵 上海源叶生物科技有限公司；2-甲基-3-庚酮标准品、系列正构烷烃、考马斯亮蓝R-250 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

ZT1000杀菌釜 诸城中泰机械有限公司；D-500匀浆机 德国Wiggens公司；Synergy H4酶标仪 美国BioTek公司；UKD159凯氏定氮仪 北京盈盛恒泰科技有限责任公司；24DN制胶器 北京市六一仪器厂；EPS-300X电泳仪 美国C.B.S.Scientific公司；TS-200脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Gel-Doc-XR型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；Zetasizer纳米粒度电位仪 英国Malvern Panalytical有限公司；HH-1型数显电子恒温水浴锅 上海至翔科教仪器厂；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；GC-MS联用仪、TG-WAX MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

对月盛斋传统酱牛肉原料肉、滚揉样品进行取样，并将成品分别在90、105、110 ℃和120 ℃条件下进行杀菌，杀菌时间20 min。共7 个取样点，分别为原料肉、滚揉后样品、煮制后成品、90 ℃杀菌样品、105 ℃杀菌样品、110 ℃杀菌样品、120 ℃杀菌样品，记为A、B、C、D、E、F、G。

1.3.2 全肌肉蛋白、水溶性蛋白和盐溶性蛋白浓度测定

采用Bechtel等[21]的方法并略作调整，6 g肉样中加入30 mL提取液（2% SDS，10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0），10 000 r/min匀浆2 min，静置1 h，4 ℃、8 000 r/min离心7 min，上清液即为全肌肉蛋白溶液。

2 g肉样中加入40 mL磷酸缓冲液（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L NaH2PO4），10 000 r/min匀浆2 min，4 ℃、8 000 r/min离心7 min，收集沉淀和上清液，上清液部分即为水溶性蛋白溶液。

上述沉淀部分中加入40 mL提取液（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L NaH2PO4，0.7 mol/L NaCl），10 000 r/min匀浆2 min，4 ℃静置过夜，然后4 ℃、8 000 r/min离心7 min，上清液即盐溶性蛋白溶液。

用BCA蛋白浓度测定试剂盒对提取的全肌肉蛋白、水溶性蛋白及盐溶性蛋白浓度进行测定，测定其在波长562 nm处吸光度，并通过标准曲线进行计算，牛血清蛋白为标准品。

1.3.3 总氮、水溶性氮、非蛋白氮、蛋白降解指数的测定

参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[22]，称取0.5 g样品中加入2 粒消化片和10 mL浓硫酸，350 ℃消化2 h，用凯氏定氮仪测定总氮含量。

参照Visessanguan等[23]的方法并进行适当调整。称取10 g样品，加入50 mL蒸馏水，4 ℃磁力搅拌提取10 min后，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集上清液。向离心后的沉淀中加入50 mL蒸馏水，重复以上操作，合并上清液。经滤纸过滤后取10 mL上清液，加入2 粒消化片和10 mL浓硫酸，350 ℃消化2 h后，用凯氏定氮仪测定滤液中水溶性氮的含量。

取上述滤液按照1∶1加入20%三氯乙酸溶液，常温静置0.5 h，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，取10 mL上清液，加入2 粒消化片和10 mL浓硫酸，350 ℃消化2 h后，用凯氏定氮仪测定滤液中非蛋白氮的含量。蛋白降解指数按式（1）计算：

1.3.4 SDS-PAGE测定

参考Laemmli[24]的方法，制备不连续SDS-PAGE系统，并适当调整优化。

分离胶的制备：12%分离胶，需30%丙烯酰胺混合液3.6 mL，1.5 mol/L的Tris-HCl（pH 8.8）2.25 mL，10% SDS 0.09 mL，去离子水2.97 mL，10%过硫酸铵0.09 mL，四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）0.003 mL。用吸管吸取4～4.5 mL分离胶溶液，沿隔板加入凝胶模具内，小心避免产生气泡，在分离胶溶液上覆盖一层1～5 mm的水层，使分离胶表面变得平整，并防止凝固过程中变干。等待30～60 min，使凝胶聚合。

浓缩胶的制备：4%浓缩胶，需30%丙烯酰胺混合液0.67 mL，1.0 mol/L的Tris-HCl（pH 6.8）0.625 mL，10% SDS 0.05 mL，去离子水3.625 mL，10%过硫酸铵0.05 mL，TEMED 0.004 mL。吸去水层，用吸管吸取浓缩胶缓慢加入至玻璃板顶端，插入梳子，聚合30～40 min后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，预先接好电极，将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

制备样品和上样：调整水溶性蛋白和盐溶性蛋白质量浓度分别为3 mg/mL和2 mg/mL，取40 μL样品，加入10 μL 5×上样缓冲液并混合均匀，煮沸变性10 min。样品上样量为20 μL，彩虹245广谱蛋白Marker上样量为5 μL。

电泳：将电泳仪电压调至80 V恒压约30 min，使样品通过浓缩胶；电泳仪调节电压至120 V恒压约1～1.5 h，等样品跑至凝胶底部，关闭电源。

染色与脱色：将凝胶放入容器中，加入没过凝胶的考马斯亮蓝染液，在摇床上振荡染色1 h。弃去染液，将凝胶在水中漂洗后加入没过凝胶的脱色液，振荡过夜后成像并观察结果。

调整水溶性蛋白和盐溶性蛋白质量浓度为1 mg/mL，用Zeta sizer纳米粒度电位仪测定蛋白质粒径。水溶性蛋白分散剂为水，盐溶性蛋白分散剂为0.7 mol/L NaCl溶液。

1.3.6 水溶性、盐溶性蛋白表面疏水性

1.3.6.1 水溶性蛋白表面疏水性

参考Yongsawatdigul等[25]的方法。将水溶性蛋白用0.01 mol/L磷酸缓冲液配成质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL的蛋白溶液，取4 mL溶液加入20 μL 8 mmol/L的1-苯氨基萘-8-磺酸铵溶液，旋涡混匀，避光10 min，测定样品荧光强度。激发波长390 nm，发射波长470 nm，以蛋白质质量浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。

1.3.6.2 盐溶性蛋白表面疏水性

参考Chelh等[26]的方法。使用0.01 mol/L磷酸缓冲液+0.7 mol/L NaCl，调整盐溶性蛋白质量浓度为4 mg/mL，取1 mL样品，加入200 μL 1 mg/mL的溴酚蓝溶液，旋涡混匀10 min，空白为1 mL磷酸缓冲液+200 μL 1 mg/mL溴酚蓝溶液，本底为磷酸缓冲液（上机时扣除）。4 000 r/min离心10 min，取上清液于波长595 nm处测定吸光度（A）。表面疏水性按式（2）计算：

1.3.7 挥发性风味物质分析

人工操作对硫酸铜产品存在难以避免的潜在污染，恶劣的工作环境对员工的职业卫生健康也会产生一定的影响。所以，实现自动化包装是托盘码垛［3］包装发展的必然趋势。车间现有两套硫酸铜包装系统，包装规格均为每袋25kg。硫酸铜生产［4］工序产出的硫酸铜通过螺旋输送机输送至中间仓，硫酸铜在中间仓缓存，再由螺旋输送机输送至计量仓，计量好的硫酸铜灌装到包装袋中，再由皮带输送至自动封包机进行封包，封包好的硫酸铜再由皮带输送至码垛工位，码垛后由人工进行装卸车。

切碎并准确称量10 g肉样置于顶空样品瓶中，加入0.2 g NaCl以及1 μL质量浓度为0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮，用聚四氟乙烯隔垫密封，将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入萃取瓶中，于50 ℃水浴中平衡10 min后推出纤维头开始萃取30 min。然后将萃取头插入GC-MS进样口解吸6 min，同时启动仪器采集数据，每个样品重复3 次取平均值。GC-MS参考贡慧等[27]的方法并适当调整。

GC条件：TG-WAX MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氮气（＞99.99%），流速1.0 mL/min，不分流；保持2 min。

MS条件：接口温度260 ℃；传输线温度230 ℃；电压1.2 kV；电子电离源温度280 ℃；电子能量70 eV；全扫描模式；质量扫描范围m/z40～600；扫描时间2 s。

定性分析：将所得质谱中化合物与NIST、Wiley等数据库进行对比，删除保留时间大于45 min的无香味高沸点化合物，化合物的确定以正、反相似指数均大于800为准，记为M。通过待测物的保留时间与相同条件下正构烷烃的保留时间计算待测物的保留指数（retention index，RI），与文献值进行比对，标记为R。RI按式（3）计算：

式中：N为低碳原子数正构烷烃的碳原子数；n为高低碳原子数正构烷烃碳原子数差；tx、tN+n、tN分别为待测化合物保留时间、高碳原子数正构烷烃保留时间和低碳原子数正构烷烃保留时间/min。

定量分析：通过内标物2-甲基-3-庚酮的含量及峰面积，计算每一种风味物质相对于内标物的含量，进行定量分析。按式（4）计算：

式中：C为测定的挥发性化合物含量/（μg/kg）；Ax为测定挥发性化合物的峰面积/（AU·min）；C0为内标物质量质量浓度（0.816 μg/μL）；A0为内标物的峰面积/（AU·min）；V为内标物的进样量/μL；m为测定样品的质量/g。

1.4 数据处理

采用Excel对平均值、标准差、RI、蛋白降解指数等数值进行计算；用Origin软件绘图；利用SPSS Statistics 21.0对原始数据进行Duncan显著性差异分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 全肌肉蛋白、水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量测定

如图1所示，原料肉中3 种蛋白质量浓度均为最高，随加工过程而显著下降（P＜0.05），这可能是由于加热使蛋白质发生降解，生成氨基酸；同时蛋白质的不可逆变性，使其发生沉淀，溶解度下降。后期随着杀菌温度的升高，全肌肉蛋白质量浓度有所增加，而水溶性蛋白和盐溶性蛋白的质量浓度均有所下降，但变化不显著，这可能是由于加热过程中蛋白受热变性，生成不溶于水和盐的蛋白凝胶所致，这与邹良亮[28]、章建浩[29]等的研究结果一致。对于任意样品而言，全肌肉蛋白质量浓度均为最高，其次是水溶性蛋白，盐溶性蛋白最低。

图1 酱牛肉加工过程中3 种蛋白含量的变化Fig.1 Changes in three protein components in sauced beef during processing

2.2 总氮、水溶性氮、非蛋白氮含量变化

图2a、b表明，酱牛肉加工过程中总氮含量高于水溶性氮和非蛋白氮含量。随着加工过程的进行，总氮含量明显下降（P＜0.05），这可能是由于热反应使样品中的蛋白质受热分解生成小肽、游离氨基酸及其他含氮的物质造成的；杀菌温度越高，总氮含量越低，说明高温加剧了蛋白质的降解。水溶性氮和非蛋白氮的变化趋势基本一致，滚揉后样品中水溶性氮和非蛋白氮含量均略有降低，这可能是由于滚揉液的加入有一定的稀释作用，引起水溶性蛋白的流失，使氮含量有所下降；随着加工过程的进行，样品中蛋白质发生降解等一系列的变化，使水溶性氮和非蛋白氮含量有所增加[30-31]。如图2c所示，随着加工过程的进行，蛋白质降解程度逐渐增加，杀菌温度的升高加速蛋白质的降解。随着杀菌温度的升高，蛋白降解指数的增加速度减慢，这可能是由于杀菌使酱牛肉的质构发生显著变化，水分活度下降、pH值发生改变等，抑制了蛋白质的降解，该结果与邹良亮等[28]对高温处理牛肉中蛋白质降解规律研究结果相吻合。

图2 酱牛肉加工过程中总氮（a）、水溶性氮及非蛋白氮（b）含量及蛋白降解指数（c）Fig.2 Changes in total nitrogen (a), water soluble nitrogen and nonprotein nitrogen (b), and protein degradation index (c) in sauced beef during processing

2.3 SDS-PAGE结果

如图3a、b所示，经过蒸煮以及不同温度杀菌后的酱牛肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白的SDS-PAGE图谱具有明显的变化，但2 种蛋白的谱图变化规律相似。未经加热处理样品（A和B）中蛋白的SDS-PAGE图谱蛋白质量浓度高，基本呈连续分布且条带颜色深，说明未经加热处理的样品中存在多种分子质量的蛋白质，且未发生热变性，蛋白质分子中的不耐热化学键未发生断裂。经过杀菌的样品中蛋白质发生热变性，大多数不耐热的化学键发生断裂，电泳条带明显变少。如图3a所示，水溶性蛋白经过热加工后已完全变性，基本没有明显条带，但G组条带变深，这可能是由于过高的杀菌温度使蛋白发生过度聚合，形成了新的聚集体；盐溶性蛋白SDS-PAGE图表明，热处理后样品中大部分蛋白质已完全降解，只有分子质量约为35 kDa的肌联蛋白和45 kDa的肌动蛋白（热稳定蛋白）依然存在[32]，但随着温度的升高，条带颜色逐渐减弱。

图3 酱牛肉加工过程中水溶性蛋白（a）及盐溶性蛋白（b）SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PAGE patterns of water soluble protein (a) and salt soluble protein (b) in sauced beef during processing

2.4 水溶性蛋白、盐溶性蛋白粒径分析

如图4所示，酱牛肉样品中水溶性蛋白与盐溶性蛋白粒径变化规律基本一致，滚揉后牛肉（B）中水溶性蛋白和盐溶性蛋白粒径显著增加（P＜0.05），这可能是由于滚揉过程使盐溶蛋白大量析出，与滚揉液中卡拉胶等其他成分结合形成凝胶体系，蛋白分子间的黏结性增大，交联作用增加，从而导致蛋白粒径增加；熟制过程使蛋白质变性，蛋白分子间不耐热的化学键断裂，交联作用减弱，蛋白粒径随之显著降低；加热后蛋白粒径大小有所波动，但整体变化不大。

图4 酱牛肉加工过程中蛋白粒径变化情况Fig.4 Variation in protein particle size in sauced beef during processing

2.5 水溶性蛋白和盐溶性蛋白表面疏水性分析

如图5所示，滚揉过程使蛋白质表面疏水性明显上升，这可能是由于滚揉过程破坏了维持α-螺旋结构稳定的氢键，而促使其向其他结构转化[33-34]，表面疏水性增强；同时，滚揉液中所含的食盐，也会使蛋白质表面疏水性增大，这与Melander等[35]的研究结果一致。熟制过程中蛋白质发生变性，暴露的疏水面互相作用而发生聚集，使蛋白分子比表面积减小，表面疏水性显著降低（P＜0.05）。C～G，随着杀菌温度的升高，用于维持蛋白质空间构象的作用力逐渐减弱，氢键、范德华力、二硫键等遭到破坏，蛋白质的二级、三级结构发生改变，原先位于分子内部的一些疏水性基团暴露在蛋白质分子的表面，从而使蛋白质表面疏水性增加[34,36]。

图5 酱牛肉加工过程中蛋白表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of proteins in sauced beef during processing

续表1

2.6 酱牛肉加工过程中挥发性风味物质含量变化

使用HS-SPME-GC-MS对加工过程中酱牛肉中挥发性风味物质进行鉴定，结果如表1所示，不同样品组分别检测出挥发性风味物质42、50、79、70、75、79、74 种，包括酯类、醇类、醛类、醚酮类、酸类、烷烃类以及杂环类物质，各类物质占总挥发性风味物质的比例如图6所示。

表1 酱牛肉加工过程中挥发性风味物质含量Table 1Relative contents of volatile flavor compounds in sauced beef during processing

图6 酱牛肉加工过程中各类挥发性风味物质的含量Fig.6 Relative contents of each class of volatile flavor compounds in sauced beef during processing

由表1和图6所示，原料肉中挥发性风味物质种类最少，为42 种，且物质总量最低（79.21 μg/kg）；滚揉后样品中挥发性物质种类增加至50 种，总量增加至107.82 μg/kg，这是由于滚揉液的加入，增加了挥发性风味物质的种类和含量，但变化并不显著（P＞0.05）。热加工过程中，由于蛋白质受热降解，生成的氨基酸发生脱氨、脱羧反应生成挥发性的醇、醛、硫化物等，糖和氨基酸的混合物在加热时发生Maillard反应以及Strecker降解，生成一系列挥发性风味物质，以及煮制料的加入，使热处理后的酱牛肉样品（C）中酯类、醇类、醛类、醚酮类、烷烃类和杂环类物质含量显著增加（P＜0.05），酸类物质含量显著下降。未杀菌样品（C）中挥发性风味物质含量最高，达613.49 μg/kg，不同温度杀菌后样品中总挥发性风味物质含量均有所降低，这可能是由于杀菌过程使样品中酯类、醇类、醛类物质进一步发生降解、氧化等反应，使含量发生变化，这与王明[37]、孙承峰[38]等的研究结果一致。对于不同杀菌温度的样品（D～G），随着杀菌温度的升高，挥发性风味物质总量先增加后减少，105 ℃杀菌样品（E）中挥发性风味物质显著高于其他杀菌温度样品（P＜0.05），达577.68 μg/kg，与未杀菌样品中挥发性物质含量无显著差异（P＞0.05），这可能是由于一定的温度能够促进蛋白质和氨基酸的降解及脂质的氧化，使正己醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、α-松油醇、壬醛、苯甲醛、羟基丙酮等物质含量增加，醛类、酮类物质阈值一般较低，对产品整体风味贡献具有十分重要的作用[39]，但过高的杀菌温度会造成蛋白质的过度变性及氧化，加速酯类物质的降解和氧化，正辛醛、壬醛、癸醛、3-蒈烯、2-正戊基呋喃等物质含量显著增加[40-41]。

3 结 论

对加工过程及不同杀菌温度酱牛肉样品（原料肉、滚揉、煮制、90 ℃、105 ℃、110 ℃、120 ℃杀菌）水溶性蛋白和盐溶性蛋白浓度、蛋白降解指数、SDS-PAGE、蛋白粒径、表面疏水性以及样品挥发性风味物质进行检测分析。结果表明，7 组样品中分别检测出挥发性风味物质42、50、79、70、75、79、74 种，包括酯类、醇类、醛类、醚类等物质，总量分别为79.21、107.82、613.49、458.81、577.68、483.58、385.85 μg/kg。滚揉过程以及滚揉液的加入，使蛋白质量浓度下降，粒径和表面疏水性增加，蛋白降解程度不明显，风味物质的增加主要来源于香辛料的作用。热加工过程使蛋白质构象发生改变，蛋白质量浓度及蛋白粒径、表面疏水性显著下降，蛋白质降解生成风味物质或风味前体物质，使煮制样品中挥发性风味物质含量显著增加。经过杀菌后，各组样品挥发性风味物质总量均有所降低，蛋白降解指数显著增加但增加速率逐渐减慢，结合SDS-PAGE结果，过高的杀菌温度可能造成蛋白的过度变性，形成新的聚合体，挥发性风味物质总量有所降低。综上，酱牛肉加工过程中，加工过程能够促进蛋白质降解及挥发性风味物质的形成，但过高的杀菌温度会影响酱牛肉中蛋白质的过度变性及氧化，105 ℃杀菌的酱牛肉风味与未杀菌样品最为接近，显著高于（P＜0.05）其他杀菌温度的样品，为传统酱牛肉产品的工业化及风味调控提供理论依据，为进一步研究蛋白降解与风味形成机制的关系提供一定理论基础。