球等鞭金藻培养条件的响应面法优化

田 镇，曹 奕，陈爱华，吴杨平，张 雨，陈素华，张志东，李秋洁

（1.江苏省海洋水产研究所，江苏南通 226007；2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306）

球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）隶属于金藻门（Chrysophyta），是1938年被首次分离出来的单细胞藻类［1］，其可以通过自身光合作用，吸收水体中无机氮（主要是氨氮），用于自身生长与繁殖，完成氮素的转移；由于其个体小、繁殖快的优势，球等鞭金藻成为新概念引领下极具潜力的绿色污水处理技术的主要微型藻类之一［2］。因其营养价值较高，也常作为饵料被用于文蛤（Meretrixmeretrix）、大竹蛏（Solengrandis）、缢蛏（Sinonovaculaconstricta）等双壳贝类的人工育苗中［3］。

比生长速率是指单位时间内单位质量的单细胞生物所增加的生物量，它是反映微藻、细菌等单细胞生物生长速率的重要参数［4］。比生长速率不仅能够准确反映出单细胞藻类在一定时间的特定生长率，更能综合体现藻类生长与死亡率平衡的动态变化。响应面法是统计学与数学相结合的方法，它不仅有着正交实验中的交互作用，还可以利用数学模型得到响应与各变量之间的函数关系式，从而进一步对全部变量因素组合进行预测得到最优响应面值，并因其具有实验次数少、周期短以及多因素相互作用等诸多优势，近年来被大量应用于食品和医药等多个领域中［5－6］。目前，有关单细胞藻类仅见温度［7－8］、光照［9－10］等单因素对单细胞藻类生长的影响研究，以及藻类生长繁殖对水环境（N、P等）的影响研究［11－12］，而环境因素交互作用对单细胞藻类生长的研究报道较少见，仅见于采用正交法优化小球 藻（Chlorellavulgaris）［13］、双 鞭 甲 藻（Crypthecodiniumcohni）［14］等单细胞藻类培养条件，但鲜见球等鞭金藻培养的响应面法优化的报道。因此，本文以球等鞭金藻比生长速率为指标，通过响应面法优化其在适宜温度、盐度及接种量的最佳条件，旨在为球等鞭金藻实验室培养、规模化繁育等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用藻类为江苏省文蛤良种场所培养的球等鞭金藻藻液，藻类培养海水取自江苏启东近海，经砂滤池黑暗沉淀处理并经二次煮沸后使用。取3 500 mL实验用水于5 000 mL三角烧瓶中，并加入15 mL的实验营养液。营养液配方为：25 mg·L－1NaNO3、2.5 mg·L－1K2HPO4、2.5 mg·L－1C6H5FeO7、8 mg·L－1EDTA。所用仪器器皿均采用医用酒精消毒后使用。在实验所设定的特定光照条件下进行培养，光照强度约为6 000 lx，光照周期为12 h。为避免藻类沉淀，每天摇晃实验烧瓶2～3次，培养周期为4 d。

1.2 单因素实验

1.2.1 温度对球等鞭金藻比生长速率影响实验

实验设置5个温度梯度：22、24、26、28、30℃，并设置3组重复。室温为22℃，采用加热板水浴调控温度；实验盐度为30，藻类接种量为1.30×106个·mL－1，pH为8.7，培养条件及方法同1.1。4 d后利用血球计数板进行计数得到最终藻类浓度，并根据公式计算出球等鞭金藻的比生长速率。

1.2.2 盐度对球等鞭金藻比生长速率影响实验

实验设置5个盐度梯度：18、21、24、27、30，并设置3组重复。盐度利用淡水进行稀释并通过盐度计进行观测确定实验水体盐度，温度设置为22℃，藻类接种量为1.30×106个·mL－1，pH为8.7，培养条件及方法同1.1。4 d后利用血球计数板进行计数得到最终藻类浓度，并根据公式计算出球等鞭金藻的比生长速率。

1.2.3 接种量对球等鞭金藻比生长速率影响实验

根据球等鞭金藻母液浓度调节实验瓶中藻类接种量，实验设5个接种梯度，0.70×106、1.00×106、1.30×106、1.60×106、1.90×106个·mL－1，并设置3组重复。温度设置为22℃，盐度为30，pH为8.7，培养条件及方法同1.1。4 d后利用血球计数板进行计数得到最终藻类浓度，并根据公式计算出球等鞭金藻的比生长速率。

1.3 多因素实验

在单因素实验的基础上，以球等鞭金藻比生长速率为指标，运用响应面法Box-Benhnken（BBD）模型，选择3因素3水平的中心组合方案，以温度（A）、盐度（B）和球等鞭金藻接种量（C）为主要考察因素，进行响应面实验，实验因素水平编码见表1，实验装置及方法同1.1。

表1 因素水平表Tab.1 Design table of factors and levels

1.4 比生长速率的测定

球等鞭金藻的比生长速率采用如下公式计算［15］：

式中，C0（106个·mL－1）指藻类的起始浓度，Ct（106个·mL－1）指实验结束时藻类的浓度，t（d）指实验时间，μ（d－1）指球等鞭金藻的比生长速率。

1.5 数据统计

单因素实验所得数据均用Excel 2016整理，并用Origin 8.0作图。通过SPSS 22.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA），若差异显著（P＜0.05），再作LSD法多重比较。多因素实验采用Design-expert 8.0软件BBD模型进行实验设计和响应面法分析。实验结果均以平均值±标准差（means±SD）表示。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

温度和盐度是影响海洋藻类生长的重要环境因素，会一定程度地影响海洋单细胞藻类的细胞分裂周期、酶的活性、吸收利用营养物质的效率，进而影响整个藻类生长繁殖过程［16－18］。单因素研究结果（图1，图2）显示，当温度在22～30℃时或盐度在18～30时，球等鞭金藻的比生长速率会呈先升高后降低的趋势。其中在温度26℃、盐度27时，球等鞭金藻的比生长速率达到最大，且温度和盐度的交互作用对球等鞭金藻的比生长速率影响显著（P＜0.05）。这与塔玛亚历山大藻（Alexanduriumtamarense）［19－20］、小球藻（Chlorellavulgaris）［13］生长规律一致。其原因可能是，温盐过高或者过低可能会抑制某些酶的活性，降低藻体内部的CO2溶解度，使得光合作用下降，进而影响藻体物质合成和能量代谢的过程，从而影响其生长繁殖［22－23］。

图1 温度对球等鞭金藻比生长速率的影响Fig.1 Effect of temperature on the specific growth rate of Isochrysis galbana

图2 盐度对球等鞭金藻比生长速率的影响Fig.2 Effect of salinity on the specific growth rate of Isochrysis galbana

接种量的多少是影响藻类生长繁殖的重要因素，在实际生产过程中，接种量多少会直接影响藻类培养效率［24］。研究结果（图3）显示，球等鞭金藻比生长速率在接种量为（0.70～1.90）×106个·mL－1时呈先增大后减小的趋势，在1.30×106个·mL－1时，比生长速率达到最大。这可能是由于在接种量为（0.70～1.30）×106个·mL－1时，球等鞭金藻营养充分，比生长速率逐渐升高。当超过1.30×106个·mL－1，由于培养基中代谢废物积累量逐渐增多、营养盐含量逐渐减少、藻细胞接触抑制等原因，球等鞭金藻的生长逐渐受到抑制，甚至停止［25］。这与眼点拟微绿球藻（Nannochloropsisoculata）、三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）、中 肋 骨 条 藻（Skeletonemasp.）的生长规律一致［26］。

图3 接种量对球等鞭金藻比生长速率的影响Fig.3 Effect of inoculation level on the specific growth rate of Isochrysis galbana

2.2 响应面多因素交叉试验

为进一步研究温度、盐度、接种量3个因素之间的交互作用对球等鞭金藻生长的影响，通过响应面法优化得到球等鞭金藻的最佳比生长速率。本实验球等鞭金藻在多因素交叉条件中培养，实验交叉设计及结果见表2。回归曲线模型表明（表3），F值为30.68，P＜0.000 1，模型的决定系数（r2）为0.975 3，说明该模型具有较好的拟合性，可以用于3个因素对球等鞭金藻的比生长速率分析。偏差系数（adeq precision）代表实验的精确度，偏差系数越小，实验的可靠性越高，本次实验的偏差系数仅为14.9%，说明本实验可信。经方差分析（表3），温度的单因素效应对球等鞭金藻比生长速率的影响显著（P＜0.05），盐度的线性效应对球等鞭金藻比生长速率的影响不显著（P＞0.05），接种量的线性效应对球等鞭金藻比生长速率影响不显著（P＞0.05），温度、盐度和接种量3因素间的曲面效应都能够对球等鞭金藻比生长速率影响极显著（P＜0.01）。这和单因素实验中得出的结论基本相同。通过响应面法得出，球等鞭金藻比生长速率预测值μ对自变量A（温度）、B（盐度）和C（接种量）的编码值二次多项式回归方程为：

表2 实验设计与结果Tab.2 Box-Benhnken design with the observed responses

表3 回归模型方差分析Tab.3 ANOVA for the regression model

球等鞭金藻比生长速率预测值对实际值自变量A、B和C的二次多项式回归方程为：

通过对球等鞭金藻生长条件优化预测建立上述模型并绘制响应面图（图4），得出温度、盐度和接种量3个因素的最优组合条件为：温度26.38℃、盐度26.61和接种量1.29×106个·mL－1。此时球等鞭金藻的比生长速率的预测值可达0.44 d－1。

图4 交互作用对球等鞭金藻比生长速率影响的响应面图Fig.4 Response surface showing interactive effects of factors

2.3 模型验证

通过BBD模型得到球等鞭金藻比生长速率的最优条件。选择同一批藻种，设计3个平行试验组，实验预测结果和实际验证结果见表4。验证结果表明，模型预测与实际验证的比生长速率并无显著性差异（P＞0.05），响应面模型分析方法可靠。在实际生产过程中可以利用设备对各变量进行精准控制，设置培养条件为：温度26℃左右、盐度27左右、接种量1.30×106个·mL－1左右，以保证球等鞭金藻的比生长速率为最大值。

表4 实验结果验证Tab.4 Experimental results verification