橡胶树叶片衰老相关基因HbLEA3 的克隆与表达分析

邹 智 郭运玲 孔 华

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室，海南 海口 571101）

胚胎发育晚期丰富（LEA）蛋白是一类高度亲水的小分子蛋白，因其最早发现于棉花胚胎发育后期的子叶而得名，他们广泛参与生物体的渗透调节和胁迫应答[1]。在植物中，该类蛋白成员众多，其根据特有的Pfam 结构域可分为8 大家族，即LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、LEA_6、DHN（dehydrin）和SMP（seed maturation protein）[2-3]。与其他家族相比，有关LEA_3 的研究相对较少。该家族早期命名为LEA5 或D−73，在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中报道的51 个LEA 中，有4 个可归为该家族，即AtDI21（AT4G15910）、AtSAG21/AtLEA5（AT4G-02380）、AtLEA3（AT1G02820）和AT3G53770[2]。亚细胞定位分析表明，除AtLEA3 胞质定位外，其他3 个蛋白都定位在线粒体；组织特异性蛋白组学分析显示，AtDI21 和AtLEA3 主要分布于花中，而AtLEA5 分布于花和根中[4]。这些基因在正常生长条件下的表达丰度都比较低，但逆境胁迫可诱导AtDI21和AtLEA5的表达，其中，AtLEA5还与叶片衰老相关[5-7]。深入研究发现，过表达AtLEA5可提高酵母对氧化胁迫的耐受能力，而在拟南芥中的过表达则可促进开花和植株衰老，初生根的长度和地上部分的生物量也随之减少[8-9]。虽然如此，与拟南芥相比，其他植物中有关LEA_3家族基因的研究还鲜见报道，尤如橡胶树（Hevea brasiliensis）等非模式木本植物。

橡胶树隶属于大戟科，最早起源于南美的亚马逊河流域，由其生产的天然橡胶是一种重要的工业原料和战略物资[10-12]。与原产地相比，我国植胶区地处热带北缘，除病虫害外，寒害、旱害和风害等严重影响我国橡胶树的分布、生长以及橡胶产量[13-15]。因此，开展橡胶树逆境生物学研究、挖掘抗逆相关基因具有重要的理论意义和应用价值。在前期的研究中，研究组通过利用HbCAB1、HbSAG12H1等标记基因成功构建了成熟和衰老叶片的转录组文库[14,16-18]，从中筛选到一个在衰老叶片中显著上调的LEA3类基因，本文重点报道该基因的序列特征及其在叶片发育过程中和逆境胁迫下的转录调控模式。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为1 年龄的热研7−33−97 组培苗，古铜期、变色期、淡绿期、成熟期、衰老早期和衰老中期等6 个典型发育时期叶片的采集详见文献[14,17]。与深绿的成熟期叶片相比，衰老期叶片在外观上呈现出不同程度的黄化。为保持材料的一致性和可重复性，研究将衰老早期和衰老中期叶片中的叶绿素含量分别定义为成熟期叶片的15%～25% 和45%～55%[17]。胁迫因子和逆境相关植物生长调节剂的处理均采用成熟期的叶片，分别为4 ℃低温、30% PEG 6000、250 mmol/L 氯化 钠（NaCl）、50 μmol/L 过氧化氢（H2O2）、50 μmol/L 脱落酸（ABA）、50 μmol/L 乙烯利（乙烯释放剂）、50 μmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L 水杨酸（SA），采集处理0、3、6、12、24 h 后的样品，液氮速冻后置于−80 ℃超低温冰箱保存备用。橡胶树的基因组和转录组数据下载于NCBI 数据库。酶、试剂盒等各种生化试剂和实验耗材详见文献[19]。

1.2 分析方法

1.2.1 基因克隆与序列分析

HbLEA3的转录本序列来源于研究组从头组装的转录组数据库，序列全长1096 bp，其中包含一个303 bp 的开放读码框（ORF）、235 bp 的5′UTR 以及558 bp 的3′ UTR。BLASTn 分析表明，该序列对应于热研7−33−97 基因组Scaffold0677[20]反向链的491468 到492657，除编码区存在一个94 bp 的内含子外，未发现碱基差异。为实验克隆该基因，研究在基因编码区的两侧设计引物对HbLEA3F（5′−AGC TAC TAT ATC TGA GAC TTA GTG G−3′）和HbLEA3R（5′−TGA TAA CGA TGT AGC CAT GTA AGC−3′）。样品总RNA 的提取、反转录、基因的克隆、常规测序以及序列分析参照文献[16,19]。

1.2.2 基因的表达分析

荧光定量分析以18 SrRNA 作为内参，具体参照文献[12,15]，引物序列分别为18SF（5′−GCT CGA AGA CGA TCA GAT ACC−3′）/18SR（5′−TTC AGC CTT GCG ACC ATAC−3′）和HbLEA3Fq（5′−TTA GCG GAG AAG AAG GTG ACG−3′）/HbLEA3Rq（5′−CTC AGG AAT CCA GTT GCC AGT−3′）。实验采用大连宝生物SYBR−Green Mix 和热电Type 5100 实时定量PCR 仪 进行，反应程序为：95 ℃预变性30 s，接着是95 ℃变 性5 s 和60 ℃延 伸30 s（40 个循环），最后60 ℃延伸30 s。每个样品至少3 次生物学重复，使用2ΔΔt法计算基因的相对表达值，并用SPSS 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

根据前期的转录组测序结果，相比成熟期叶片，HbLEA3在衰老叶片中的表达丰度较高，因此，研究以衰老中期叶片反转录的cDNA 为模板进行PCR 扩增。成功克隆到HbLEA3基因652 bp 的cDNA 序列（GenBank 登陆号KP244471），其中包含173 bp 的5′ UTR、303 bp 的ORF 和176 bp 的3′ UTR。该序列与转录组及热研7−33−97基因组的对应区域完全一致，进一步证实该基因确实存在一个内含子。值得注意的是，将序列与RRIM600 基因组[21-22]进行比对发现存在7 个碱基变异，其中有5 个位于编码区（图1），而这导致了4 个氨基酸的变异。BLASTn 分析显示，该基因在公共数据中至今还没有表达序列标签（EST）。

2.2 基因的生物信息学分析

2.2.1HbLEA3编码蛋白 的理化特 性、亚细胞定位及保守结构域

HbLEA3编码区的GC 含量为41.91%，编码100 个氨基酸，预测的理论分子量（Mw）为11.61 kDa，等电点（pI）为9.07，不稳定系数（II）为32.37，脂肪族指数（AI）为78.10，GRAVY 为−0.498。在构成蛋白的20 种氨基酸中，亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）的比例最高（12%）；其次是丙氨酸（Ala）和苏氨酸（Thr）（8%）；而半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）的比例最低，仅为1%。与其他LEA 蛋白类似，HbLEA3 的亲水氨基酸高达75%，其N 端表现为疏水性，而C 端表现为亲水性（图2a）。事实上，TargetP−2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析显示，蛋白的前28 个残基为线粒体信号肽。MotifScan（https://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan）分析表明，蛋白的22～89 位为保守的LEA_3 结构域（图1 和图2b）；53～56 位为潜在的环磷酸腺苷磷酸化位点；90～93 位为酪氨酸蛋白激酶II 磷酸化位点；24～26、44～46 和90～92 位为潜在的蛋白激酶C 磷酸化位点。这表明，HbLEA3 是一个隶属于LEA_3 家族、受磷酸化调控的高度亲水的线粒体定位蛋白。

图1 HbLEA3 的cDNA 序列及其与RRIM600 基因组中相应基因序列的比较Fig.1 Comparison of the cDNA sequence of HbLEA3 with its gene sequence in the RRIM600 genome

2.2.2 多序列比对与进化分析

同源分析表明，HbLEA3 与木薯（Manihot esculenta）、蓖麻（Manihot esculenta）、麻疯树（Jatropha curcas）和可可树（Theobroma cacao）中同源蛋白的相似性分别为75.0%、67.6%、66.0%和61.8%；在模式植物拟南芥和水稻中的多个成员中，HbLEA3 与AtLEA3 和OsLEA10 的相似性最高，分别为36.0%和41.1%。与上述蛋白相比，HbLEA3 拥有较长的N 端（11 个残基，图2b）。进化分析表明，HbLEA3 与白云杉EMB12[23]聚在同一支（图2c），两者相似性为35.0%，暗示HbLEA3 的直系同源基因至少在被子与裸子植物分化之前就已经产生，并且在拟南芥中发生了丢失。

图2 HbLEA3 蛋白的亲水性图谱、多序列比对与进化分析Fig.2 Hydropathy plot,multiple sequence alignment,and phylogenetic analysis of HbLEA3

2.3 HbLEA3 基因的表达模式分析

为了解HbLEA3的表达特性，研究进一步搜索了公共数据中乳管、树皮、叶片、雌花、雄花、根和种子等不同组织的转录组数据，基于FKPM 的定量分析表明该基因主要在叶片中表达。为此，研究首先分析了基因在不同发育时期叶片中的表达模式，发现HbLEA3的表达水平随叶片的成熟而稳步上升，但在衰老早期短暂下调，随后在衰老中期显著上调（图3）。

图3 HbLEA3 在不同发育时期叶片中的表达模式（将对照设为1，以差异倍数作图）Fig.3 Expression profile of HbLEA3 during leaf development

为揭示HbLEA3的转录调控模式，研究进一步分析了低温、PEG、NaCl、H2O2、ABA、乙烯、MeJA 和SA 对基因表达的影响，结果表明，这些因子均可显著诱导HbLEA3的表达，但响应模式存在一定的差异：在低温、PEG 和H2O2胁迫下，主要表现为先升后降再升的趋势；在NaCl和MeJA 胁迫下，呈单峰型；在乙烯、ABA 和SA 胁迫下，主要表现为先降后升趋势（图4）。

图4 HbLEA3 对主要胁迫因子和逆境激素的响应模式Fig.4 Expression patterns of HbLEA3 upon several hormone and abiotic stress treatments

3 结论与讨论

LEA 蛋白作为一类与植物逆境适应密切相关的明星分子而被广泛关注[2-4]。在橡胶树中，先前报道了5 个LEA类基因，其中3 个属于LEA_2 家族[25-27]，另外2 个属于DHN 家族[28-29]。本研究报道了一个LEA_3 家族成员，命名为HbLEA3。该基因含有1 个内含子，预测编码100 个氨基酸，蛋白含有1 个保守的LEA_3 结构域，碱性、高度亲水。与其他同源蛋白相比，HbLEA3 拥有一延伸的N 端。由于橡胶树与麻疯树、蓖麻、木薯同属大戟科，且橡胶树和木薯在与蓖麻和麻疯树分化之后共享了一次叫做ρ 的全基因重复事件（3900～4700 万年前）[30-32]，这表明HbLEA3极可能通过近期的碱基突变额外获得了N 端的这11 个氨基酸。与多数拟南芥LEA3 蛋白类似[4]，HbLEA3 预测定位在线粒体。

包含白云杉（Picea glauca）PgEMB12、4 个拟南芥LEA3 蛋白和5 个水稻（Oryza sativa）LEA3 蛋白的进化分析表明，LEA_3 家族至少含有3 个亚类，而HbLEA3 和PgEMB12[24]所处的亚类在裸子植物与被子植物分化之前就已形成，后期在不同物种中出现了不同的进化模式，如在拟南芥中发生了丢失，而在水稻中出现了较大水平的扩张（存在3 个成员）。目前有关LEA_3 家族的研究主要集中在4 个拟南芥LEA3 蛋白所处的分支，如绿豆（Vigna radiata）的Arg2[33]、棉花（Gossypiumspp.）的LEA5/D−73[34]、沙姆提橙（Citrusspp.）的C−Lea5[35]和马铃薯（Solanum tuberosum）的32B[36]，他们与下胚轴的伸长、块茎的发育以及非生物胁迫响应相关。与AtLEA5类似，HbLEA3在衰老叶片中高水平表达，而其稳步上升的表达模式暗示该基因可能参与了叶片的发育。考虑到低温、PEG、NaCl、H2O2、ABA、乙烯、茉莉酸和水杨酸等胁迫因子或逆境相关植物生长调节剂均可诱导叶片衰老，研究深入分析了他们对HbLEA3的转录调控模式，事实证明这些因子均可诱导HbLEA3的表达，虽然在某些时间点也存在抑制作用。有趣的是，HbLEA3对这8 种因子表现3 种主要的响应模式，先升后降再升型包括低温、PEG 和H2O2，单峰型包括NaCl和MeJA，先降后升型包括乙烯、ABA 和SA。事实上，除AtDI21和AtLEA5外，PgEMB12受ABA和PEG 诱导[24]；Arg2受IAA、机械损伤和热击诱导[33]；C−Lea5受NaC1、干旱和热击诱导[35]；Os-LEA10和OsLEA12受ABA、PEG 和NaCl 诱导[37]。

综上，研究表明HbLEA3是一个与橡胶树叶片发育和胁迫响应相关的胚胎发育晚期丰富蛋白基因。虽然如此，更多的实验如在原核生物和模式植物中过表达或进行内源敲除将有助于进一步阐明HbLEA3的生物学功能及调控通路。