十味降糖散对糖尿病大鼠肝脏、脂肪AMPKα和肾CTGF因子表达的调节

蔡 彬 , 张东彦 , 栾思琦 , 苟金花 , 冯雪倩 , 马林凤 , 陶 瑞 , 唐 静 ， 罗 军 , 贺闪闪 , 郑小波

(西南大学动物科学学院 ， 重庆 荣昌 402460)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素等各种致病因子[1]等引发的，DM中以Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)为主，占比超过90%，Ⅱ型糖尿病患者常常伴随着糖、蛋白质和脂肪等代谢紊乱，T2DM患者容易发生感染、肾功能衰竭等并发症[2]，其中糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是Ⅱ型糖尿病严重的肾脏相关并发症。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种丝氨/苏氨酸蛋白激酶，也是一种关键的能量感受器，通过调节细胞代谢来维持细胞内能量平衡[3]，AMPK是一个由 α、β 和 γ 三个亚单位组成的三聚体，α 亚基具有催化作用，主要分布于肝、肾、肺、心脏和脑，AMPK被激活后可以增强葡萄糖摄取利用，可以产生更多能量，同时能够减少葡萄糖异生，糖原、甘油三脂的合成代谢，从而调节机体能量平衡[4]； 肝脏参与糖类和脂肪代谢，是糖类储存和释放以及脂肪合成的主要器官，肝脏能抑制葡萄糖和脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化，脂肪中AMPK能抑制脂肪酸的合成和分解，AMPK被激活能够减少脂肪和甘油三酯的合成[5]。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)是肾小球硬化和肾小管间质纤维化过程中的关键性细胞因子，肾小球肥大和肾小管间质纤维化与CTGF的高表达呈正相关[6-7]。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的Ⅱ型糖尿病模型，对大鼠肝肾功能有损害作用，从而使得肝脏AMPK和肾脏CTGF的表达受到影响。本试验研究十味降糖散对肝脏、脂肪AMPKα和肾CTGF表达的影响，进一步探究十味降糖散对肝肾保护和脂代谢的机制，为十味降糖散的临床应用与开发提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，4周龄，体重为(95±5) g，购自成都达硕实验动物有限公司(四川省实验动物检测中心提供，合格证号：0015190)。

1.2 试验药品配制 十味降糖散:黄芩、黄连、地骨皮、玄参、沙参、生地、麦冬、花粉、知母、藕汁[8-9]组成，水煎浓缩为含生药500 g/L。高糖高脂饲料：由蛋黄3%，猪油18%，蔗糖20%，基础饲料59%[9]混合配制而成。

1.3 主要试剂 链脲佐菌素(STZ)，购自美国Sigma公司；AMPKα抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司；细胞裂解液，购自中国碧云天生物技术研究所；分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液，均购自中国上海哈灵生物科技有限公司；PVDF膜，购自美国Millipore公司；BSA试剂盒，购自中国Hzbscience公司；兔抗CTGF多克隆抗体、山羊抗兔IgG和DAB免疫组织化学显色试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 主要仪器 稳豪型血糖仪为上海强生医疗器材有限公司产品；CR3i型超低温冷冻离心机为Thermo Fisher 公司产品；高速离心机为上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品；全自动凝胶成像系统和凝胶成像分析系统为上海勤翔科学仪器有限公司产品；UB100i型显微镜为郑州南北仪器设备有限公司产品；SQ2125型石蜡切片机为徕克公司产品；IMS图像分析系统为基尔顿上海生物科技有限公司产品。

1.5 试验方法

1.5.1 模型的建立 采用链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病模型和糖尿病肾病(DN)模型。Ⅱ型糖尿病模型构建方法：按35 mg/(kg·bw)剂量腹腔注射[10]，72 h后测量空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，Ⅱ型糖尿病模型造模成功；糖尿病肾病(DN)模型：按45 mg/(kg·bw)的剂量腹腔注射[11]，72 h后血糖值≥16.7 mmol/L，为糖尿病造模成功的标准，在糖尿病成模2周后，取大鼠的尿液测尿蛋白，若呈阳性，大鼠的糖尿病肾病(DN)模型造模成功。

1.5.2 试验分组 将100只SD大鼠用普通饲料饲喂1周，然后随机挑选12只大鼠作为空白组，饲喂普通饲料，将需要造模的88只大鼠用高糖高脂饲料饲喂4周后，随机挑选44只诱导Ⅱ型糖尿病，随机分为模型Ⅰ组(Ⅱ型糖尿病模型)和治疗Ⅰ组；另外44只大鼠诱导糖尿病肾病(DN)，随机分为模型Ⅱ组(DN模型)和治疗Ⅱ组。治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组每天用十味降糖散灌胃1次，灌服的剂量为3 mL/(kg·bw)，模型Ⅰ组和模型Ⅱ组灌服同等比例的生理盐水；空白组大鼠不做任何处理，模型组和治疗组大鼠饲喂高糖高脂饲料直到试验结束，各组均自由饮水。

1.5.3 肝脏和睾丸脂肪垫AMPKα的测定 在造模成功的第8周，处死大鼠，分别取空白组、模型Ⅰ组和治疗Ⅰ组大鼠肝脏和右侧睾丸脂肪垫，放入液氮冷冻，-80 ℃保存。称取80 mg肝脏和脂肪，加入细胞裂解液，冰浴并研磨组织，裂解40 min。4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，保留上清液。严格按照试剂盒说明书，测定肝脏和睾丸脂肪垫组织中的AMPKα，经常规蛋白印迹法操作，凝胶成像仪成像后，蛋白条带用软件Imagine J进行分析处理。

1.5.4 肾脏CTGF的测定 在造模成功后的第10周，处死大鼠，分别取空白组、模型Ⅱ组和治疗Ⅱ组大鼠左肾，用10%的中性甲醛固定24 h后，石蜡包埋后切片，严格按照DAB免疫组织化学显色试剂盒说明书操作，选取切片不同的位点，分别在200倍和400倍镜下拍片观察，用IMS图像分析系统对切片进行半定量分析，测量CTGF蛋白平均光密度、阳性面积和阳性率。

2 结果

2.1 十味降糖散对肝脏、睾丸脂肪垫AMPKα表达的影响 Western Blot结果见图1，分析结果如图2所示，与空白组比较，模型Ⅰ组肝脏AMPKα表达极显著降低(P<0.01)；与模型Ⅰ组比较，治疗Ⅰ组AMPKα表达显著升高(P<0.05)；空白组和治疗Ⅰ组肝脏AMPKα表达无差异(P>0.05)；与空白组相比，治疗Ⅰ组和模型Ⅰ组睾丸脂肪垫AMPKα表达无差异(P>0.05)。

图1 肝脏、睾丸脂肪垫AMPKα表达的Western Blot分析Fig.1 Western Blot analysis of AMPKα expressionin liver and testicular fat pads 1～3：空白组、模型Ⅰ组、治疗Ⅰ组的肝脏； 4～6:空白组、模型Ⅰ组、治疗Ⅰ组的脂肪1-3：Liver of blank group, modelⅠgroup,treatmentⅠgroup; 4-6: Fat of blank group, modelⅠgroup,treatmentⅠgroup

图2 十味降糖散对肝脏、睾丸脂肪垫AMPKα表达的调节Fig.2 Shiwei Jiangtang powder regulates AMPKα expression in liver and testicular fat pad**：与空白组比较，P<0.01；#： 与模型Ⅰ组比较，P<0.05**： Compare to blank group, P<0.01; #: Compare to model Ⅰ group, P<0.05

2.2 肾脏免疫组织化学染色观察 由封三彩版图3可知，空白组中肾小球内几乎没有CTGF蛋白，细胞核明显，肾小管内有少量的CTGF蛋白(封三彩版图3A、3B)；模型Ⅱ组肾小球有肿大的现象，肾小管中有大量的CTGF蛋白，主要集中在近曲小管和远曲小管(封三彩版图3C、3D)；治疗Ⅱ组肾小球内CTGF蛋白较少，肾小管中有少量的CTGF蛋白，分布在近曲小管和远曲小管中，细胞核染色明显(封三彩版图3E、3F)。

2.3 肾脏CTGF蛋白的平均光密度、阳性面积和阳性率 由图4～6可知，与空白组比较，模型Ⅱ组CTGF平均光密度、阳性面积和阳性率显著升高(P<0.05)；与模型Ⅱ组比较，治疗Ⅱ组CTGF平均光密度、阳性面积和阳性率显著降低(P<0.05)；与空白组比较，治疗Ⅱ组CTGF平均光密度、蛋白阳性面积和阳性率密度差异不显著(P>0.05)。

图4 CTGF蛋白表达的平均光密度比较Fig.4 Comparison of average optical density of CTGF protein expression*：与模型Ⅱ组比较， P<0.05；下图同*：Compare to modelⅡgroup, P<0.05. The same as below

3 讨论

AMPKα调节糖、脂肪、蛋白质等物质的代谢，在肝脏、脂肪、肌肉组织中均有表达，肝脏是葡萄糖代谢的主要场所，增加葡萄糖的摄取和利用，促使能量代谢趋于平衡。肝脏AMPK主要通过抑制糖异生和葡萄糖产生来控制葡萄糖，黄芩有降低血糖、血脂，黄连有降血糖、抗心律失常等作用，黄芩、黄连属于清热燥湿配伍，常需合用起协同增效作用[12]，地骨皮具改善胰岛功能，增加胰岛素的分泌，从而降低血糖[13]；十味降糖散能够促进糖尿病大鼠肝糖原的合成，降低糖化血红蛋白，降低脂联素含量[8]，脂联素能够激活AMPK，抑制葡萄糖-6-磷酸酶(G6 Pase)的活性，从而减少肝糖产生[14]，调节糖尿病造成的糖代谢紊乱。本试验表明,十味降糖散可以上调糖尿病大鼠肝脏AMPKα的表达，调节机体糖代谢，从而对肝脏起保护作用。

图5 CTGF蛋白表达阳性面积的比较Fig.5 Comparison of positive area of CTGF protein expression

图6 CTGF蛋白表达阳性率比较Fig.6 Comparison of positive rate of CTGF protein expression

脂肪细胞AMPK能够抑制脂肪酸的合成和分解，促进脂肪酸氧化[15]，通过感受胞质内AMP/ATP比值的改变，当AMP/ATP增高时，AMPK磷酸化为p-AMPK而激活[16]，激活的AMPK可以使乙酰辅酶A 羧化酶(ACC)磷酸化而失活，ACC通过催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A，在脂肪酸的代谢过程中发挥重要的作用，而抑制ACC活性可以抑制脂质合成[17-18]。地骨皮总黄酮通过降低血胆固醇和三酰甘油，调节血脂水平[19]；天花粉凝集素调节血脂水平有显著作用，能够促进脂代谢的良性循环；十味降糖散可以增强血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性，升高血清高密度脂蛋白(HDL)含量，降低血清丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、脂联素含量，减少内脏脂肪含量，改善机体的脂肪代谢紊乱[20]。本试验表明，十味降糖散对睾丸脂肪垫AMPKα的表达无影响，调节脂肪代谢可能是通过其他途径完成的。

Ⅱ型糖尿病患者常伴发肾功能衰竭，对肾脏的损害主要是以糖尿病肾病(DN)为主，DN病程发展到微量白蛋白尿时，CTGF在肾小球区域表达增高，系膜细胞增生，可导致肾小管萎缩、硬化，促进肾间质纤维化[21]。黄芩能够缓解DN病程发展引起的肾脏病理损伤，降低尿蛋白排泄[22]，黄连、生地及其配伍对Ⅱ型糖尿病大鼠有治疗作用，但黄连、生地配伍治疗效果优于单味药[23]；十味降糖散可以抑制DN大鼠肾脏肥大，缓解大鼠体重的下降、肾功能的降低、肾小球和肾小管病变，减少尿微量白蛋白(mALB)、血清肌酐(CREA)，尿素(UREA)的增加，降低TG，提高HDL[24]。本试验结果表明，十味降糖散能够抑制DN肾组织CTGF的表达，减缓肾小管萎缩、硬化，抑制肾间质纤维化，对肾脏起到保护作用。

十味降糖散能够上调糖尿病大鼠肝脏AMPKα的表达，抑制肾脏CTGF的表达，调节机体糖脂代谢，对肝肾起到保护作用；十味降糖散对睾丸脂肪垫AMPKα的表达无影响，调节脂代谢可能通过其他途径。