猪多病原混合感染病例的诊断

韩 旭 ， Eager Wayne Johnson ， 夏兆飞

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京恩睿康农业技术咨询有限公司 ， 北京 昌平 102209)

北京地区某个500头母猪场，2019年10月保育猪死亡率高达4%。主要表现为断奶后2周开始出现明显呼吸道症状，喷嚏、咳嗽、腹式呼吸，体温升高至40～40.5 ℃，精神沉郁，厌食，个别母猪有轻度腹泻。送检4头35～55日龄保育猪进行剖检。

1 剖检病变及样品采集

4头病猪的肺脏均有不同程度的肉样变，2头猪鼻腔有脓性分泌物，提示可能有细菌感染，应进行细菌学和病理学检查。4头猪腹股沟淋巴结有不同程度的肿大，应进行PCR及病理学检查。1头猪结肠襻严重水肿、充血、轻度出血，应进行细菌学和病理学检查。其他器官未见眼观可见病变。

细菌分离培养样品：肺脏、鼻腔脓汁、关节液及脑组织。PCR检测样品：肺脏及淋巴结。病理学检查样品：肺脏间叶、心叶、膈叶，大脑、小脑、扁桃体、心肌、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠，均置于10%福尔马林溶液中固定。

2 细菌学检查

将用于细菌培养的组织接种于血平板、CNA平板(血平板加入萘啶酸及硫酸黏杆菌素以选择性培养革兰阳性菌)、麦康凯平板进行细菌分离培养，培养基购自Oxiod公司，并自行配置。

经检查，从1头猪的肺脏及鼻腔脓汁中分离到β溶血性针尖状小菌落，革兰染色镜检为革兰阳性球菌，疑为链球菌。对疑似菌落进行PCR扩增16S rRNA片段并测序，使用细菌通用型引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[1]，测序可知溶血性小菌落为猪链球菌(Streptococcussuis)。参照Okura等建立的两步多重PCR方法对分离到的链球菌进行血清型检测[2]。参照King等建立的链球菌多位点序列分型(MLST)检测方法进行基因型检测[3]，对aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA共7个管家基因进行PCR和Sanger测序，其中链球菌mutS基因改用Rehm等设计的改进型引物[4]。测序服务由美吉生物提供。进一步将测序结果上传至PubMLST进行比对分析以确定其基因型。经检测同一头猪感染了2种猪链球菌，肺脏感染的链球菌血清型为3型，基因型为ST117。鼻腔脓汁分离到的链球菌血清型为2型或1/2型，基因型为ST28。采用纸片扩散法对2株链球菌进行药敏试验，选用的药物为庆大霉素(CN)、土霉素(OT)、替米考星(TIL)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、阿莫西林克拉维酸钾(AMC)、磺胺甲噁唑-甲氧苄啶(SXT)、大观霉素(SH)、阿莫西林(AML)、青霉素(P)、磺酰胺(S3)、头孢氨苄(CL)、甲硝唑(MTZ)，药敏纸片均购自Oxoid公司，敏感药物为恩诺沙星和氟苯尼考。

严重水肿的结肠组织于麦康凯培养基上分离到大肠杆菌。致病性大肠杆菌可造成仔猪腹泻和断奶后保育猪水肿病，特别是大肠杆菌水肿病可造成肠水肿，但大肠杆菌又是结肠内的常在菌，且采样时易被环境污染。分离到的大肠杆菌是否为致病菌，需进一步鉴定是否具有肠绒毛黏附因子和毒力因子。检测的黏附因子包括5种菌毛(F4、F5、F6、F41、F18)和弥漫性黏附素AIDA。毒力因子包括热稳定毒素STa和STb，热敏感毒素LT，志贺毒素Stx2e。使用PCR方法进行检测，黏附素AIDA参照Cote等的方法[5]，其他黏附及毒力因子参照Larsson等的方法[6]。挑取多菌落进行PCR，结果在阳性对照都成立的情况下，所有黏附因子及毒力因子均为阴性，说明结肠分离到的大肠杆菌应为非致病菌，不是结肠水肿的病因。

3 常见病毒PCR检查

病毒PCR检测结果：对检测样品进行RNA和DNA的提取并检测常见病毒：猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)，所用的提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit及检测试剂盒QIAGEN OneStep RT-PCR Kit均购自QIAGEN公司；所用引物均为本试验自行设计(表1)，反应体系及扩增条件参照试剂盒推荐流程。检测结果为PRRSV及PCV2阳性，其余为阴性。分别对PRRSVORF5片段和PCV2ORF2片段进行PCR扩增并测序，经比对分析后发现，PRRSV为中国高致病性HP-PRRSV-like样毒株，该毒株与1年前从该场检测到的PRRSV毒株ORF5片段同源性100%，应为同一毒株。PCV2为PCV2 d型毒株，该型毒株为国内主要的流行毒株[7-8]。

表1 病毒引物序列

4 病理学检查

将固定好的组织样品制作成石蜡切片并进行H.E.染色。可见肺脏表现为间质性肺炎，肺泡腔内可见嗜酸性坏死团块，怀疑为PRRSV感染所致。肺泡腔、支气管、细支气管腔内可见大量中性粒细胞，怀疑为猪链球菌感染所致。淋巴结及脾脏淋巴细胞缺失，淋巴结可见嗜碱性葡萄串样核外包涵体，怀疑为PCV2引起的免疫组织损伤。结肠可见严重的黏膜下水肿，肠黏膜层出血、坏死。结肠黏膜层表面抹片后革兰和吉姆萨染色，镜检可见螺旋状细菌，怀疑为猪痢疾短螺旋体或结肠绒毛样短螺旋体。因结肠菌群组成复杂，短螺旋体生长缓慢、厌氧且易被过度生长的肠道厌氧菌抑制生长，所以未能成功分离到短螺旋体。见封底彩版图1。

5 诊断与治疗

综合诊断分析表明，猪群呼吸道症状主要由于PRRSV和链球菌感染引起，但究竟哪一种病原菌很难确定。鉴于该场既往病史，同一种PRRSV毒株长期存在于该场，保育猪并未出现明显临床症状，保育舍死亡率为1%～2%，所以怀疑猪链球菌为主要病因，PRRSV参与致病。根据药敏试验结果，建议保育舍饲料中添加氟苯尼考250 g/t，饲喂2周。发病猪肌内注射恩诺沙星7.5 mg/(kg·bw)，每24小时注射1次，连续注射3次以上。

病弱猪有圆环病毒2型造成的免疫组织损伤，建议圆环病毒2型疫苗免疫由原来的21日龄免疫1次改为7日龄、21日龄各免疫1次。圆环病毒2型疫苗为灭活苗，虽添加有缓释佐剂，但2次免疫仍优于1次免疫。

结肠中发现有短螺旋体存在，且造成了肠道损伤。建议保育饲料中添加泰妙菌素300 g/t，连续添加2周。因猪群整体只有轻微的腹泻，怀疑为结肠绒毛样短螺旋体，猪痢疾端螺旋体造成的腹泻应更加严重，发生血便。进一步研究可设计特异性引物检测肠道内容物以区分2种短螺旋体[9]，因该场腹泻症状轻微，所以未做进一步检测。该场使用发酵床养猪，发酵床垫草如处理不当，发酵不完全无法杀死有害病原微生物，此时易发生肠道细菌及寄生虫持续感染。

执行推荐措施10 d后猪群稳定，无新发病例，保育猪死亡率重新控制在2%以内。

6 讨论

本案例中同一头猪发现了2种不同血清型及基因型的猪链球菌，说明多种链球菌可同时感染同一个体，不同的链球菌可能有不同的组织嗜性，本案例中一种感染鼻腔，另一种感染肺脏。这一情况提示我们，临床中对于疑似链球菌感染的病例，应对肺脏、鼻腔、关节腔、大脑及小脑进行分开采样、分离、培养、鉴定，防止多种链球菌感染时漏检，不同的链球菌药物敏感性可能不同，所以选用的治疗药物可能也不同。链球菌的感染通常为呼吸道感染及外伤感染，呼吸道感染途径为口鼻的接触传播和短距离空气传播，外伤感染途径为剪牙、断尾、断脐、四肢外伤、不洁的肌肉注射等方式。临床剖检时应予以关注，尝试找出主要感染途径。链球菌血清型和基因型的检测有利于疾病进程的追踪，当再次发病时可确定是否为新菌种感染，还是原菌种发生了耐药变异。病毒的测序也有相同作用，可在分析毒株致病性的同时追踪疾病进展。

通常呼吸道疾病高发于秋冬季，天气转冷，猪场通常为了保证圈舍温度而降低圈舍通风量，这就造成空气中的PRRSV、链球菌等致病菌在环境中富集，引起猪群发病。因此秋冬季注重保温的同时更应关注通风管理，现代化的猪舍应有自动化控制的通风设备，根据猪群日龄保证舍内的最小通风量。

病理学检查在临床诊断中具有十分重要的意义，发现的病原菌是否造成了组织损伤，应进行病理学检查。本案例中肺部的间质性肺炎和嗜酸性坏死团块，与PCR-PRRSV阳性相互佐证。支气管及肺泡内大量的中性粒细胞与细菌分离培养得到猪链球菌相互佐证。回肠出血、坏死、水肿与细菌学检测短螺旋体阳性、致病性大肠杆菌阴性互相佐证。淋巴组织中淋巴细胞缺失、嗜碱性核外包涵体与PCR-PCV2阳性相互佐证。PCV2在国内猪场普遍感染[7-8]，是否发病应结合病理学损伤及临床症状进行评估。

猪群疾病的诊治应将病史、现场情况、剖检、细菌学、分子生物学、组织病理学诊断有机的结合起来，每种检测方式都有相应的优势和劣势，应注重综合诊断，不同方法间相互补充，互相验证，去伪存真。