红背叶根水提物对乙醇诱导的酒精性脂肪肝细胞的干预作用及可能机制▲

沈海容 王大东 罗显克 王保健 吴晓莉 农云翠

(广西壮族自治区民族医院消化内科，南宁市 530001，电子邮箱：415487460@qq.com)

陷窝蛋白(caveolin，Cav) 是分子量为21～24 kD的多功能信号蛋白，其家族成员有Cav-1、Cav-2 和Cav-3。研究表明，Cav-1是Cav家族的重要组成部分[1]，是一种高亲和力、脂质结合蛋白。Cav-1能被脂多糖、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、氧自由基、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、瘦素等多种因子激活[2]，与细胞的增殖、凋亡、迁移、炎症等密切相关[3-5]。研究表明，Cav-1在许多慢性肝脏疾病，如慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、脂肪肝等肝组织中表达升高[6]。根据组织学酒精性肝病可分为3个阶段，即脂肪肝或单纯脂肪变性、酒精性肝炎、慢性肝炎合并肝纤维化或肝硬化。我们推断Cav-1在酒精性肝病中同样扮演重要角色。本课题组前期研究表明，红背叶根对酒精性肝纤维化大鼠具有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用[7-8]，结合Cav-1在肝脏疾病中所扮演的重要角色，推测Cav-1 可能是红背叶根防治酒精性脂肪肝的作用靶点之一。本研究通过乙醇诱导建立酒精性脂肪肝离体细胞模型，观察红背叶根水提物对乙醇诱导的酒精性脂肪肝细胞中Cav-1表达水平的影响，以初步探讨红背叶根对酒精性脂肪肝的干预作用。

1 材料与方法

1.1 药物红背叶根 采自广东省惠州市，经南方医科大学中药鉴定与药用植物教研室鉴定为大戟科植物红背山麻杆的根。红背叶根水提物提取方法：红背叶根干燥粉碎后，用蒸馏水溶解，4℃、3 000 r/min离心20 min取上清，60℃水浴消毒3次。

1.2 细胞株 人胎肝L02细胞购自中科院上海细胞库。

1.3 试剂及仪器 高糖杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)购自Gibco公司；小牛血清(56℃、30 min灭活，批号：180127)购自中国浙江天杭生物科技有限公司；谷氨酰胺、四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司；0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)购自吉诺生物医药技术有限公司(批号：18112001)；青-链霉素溶液购自吉诺生物医药技术有限公司(批号：18106101)。宝特ELx800全自动酶标检测仪购自美国BioTek公司；Bx60型倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。RNA提取试剂盒TRIzol试剂(批号：18765032)和实时定量PCR试剂盒(批号:741023)均购自日本TAKARA公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养：将复苏后的L02肝细胞放入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养液，置于湿度95%、5%CO2、37℃的培养箱中常规培养，每2 d换液1次，每3～4 d用0.25%胰蛋白酶消化，以1 ∶3比例传代培养。

1.4.2 酒精性脂肪肝细胞模型的建立：将处于对数生长期的细胞消化后，以每孔5×104个细胞接种于96孔板，用含10%小牛血清的DMEM培养液置于5%CO2、37℃的培养箱中饱和湿度条件下常规方法培养4 h，待细胞贴壁后，将细胞分为对照组和不同浓度乙醇组，不同浓度乙醇组分别在培养液中加入10 μL/孔的20、40、60、80、100 mmol/L乙醇，对照组加等体积培养液。处理20 h后，每孔加入20 μL 5g/L四甲基偶氮唑盐溶液，继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入DMSO 200 μL，震荡5 min后，在酶标仪490 nm处检测吸光度(A)值。细胞存活率=A给药组/A对照组×100%。实验重复6次，每组均设有副孔求取平均值。

1.4.3 红背叶根水提物对乙醇损伤后L02 细胞存活率的影响：将细胞以每孔5×104个的密度接种于96孔板，分为空白对照组和不同浓度红背叶根组，不同浓度红背叶根组给予80 mmol/L乙醇干预24 h后，分别加入不同浓度(12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)红背叶根水提物，空白对照组只加入等体积的DMEM培养液。干预20 h后，每孔加5 g/L四甲基偶氮唑盐溶液20 μL。继续培养4 h后，弃去培养液，每孔加DMSO 200 μL，震荡5 min后，在酶标仪490 nm处检测吸光度(A)值。实验重复6次，每组均设有副孔求取平均值。

1.4.4 红背叶根水提物对乙醇损伤后L02 细胞三酰甘油水平的影响：按照1.4.3方法分组及处理细胞24 h后，采用不同浓度(3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)红背叶根水提物干预红背叶根组L02 细胞，空白对照组只加入等体积的DMEM培养液，干预20 h后收集细胞，采用细胞三酰甘油检测试剂盒(上海邦景实业有限公司，批号：19240021)检测细胞内三酰甘油水平。实验重复6次，每组均设有副孔求取平均值。

1.4.5 红背叶根水提物对乙醇损伤后L02 细胞Cav-1 mRNA表达水平的影响：按照1.4.3方法分组及处理细胞24 h后，采用不同浓度(3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)红背叶根水提物干预红背叶根组L02 细胞，空白对照组只加入等体积的DMEM培养液。干预20 h后收集细胞，采用TRIzol试剂盒提取L02 细胞的总RNA，采用紫外分光光度仪测定A260/A280比值,检测RNA纯度和浓度。采用反转录试剂盒(TaKaRa公司，批号：741023)将RNA反转录为cDNA，再以β-肌动蛋白作为内参照，用实时定量PCR法检测L02细胞Cav-1 mRNA的表达水平。所有引物采用Primer Premier 5软件设计，由武汉华联科生物技术有限公司合成。Cav-1 mRNA引物上游序列为5′-CGCCATTCTCTCTTTCCTGC-3′，下游序列为 5′-AGACGGTGTGGACGTAGA-3′，β-肌动蛋白引物上游序列5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游序列5′CTGCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR反应体系为20 μL，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行。反应条件为95℃ ，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；39 个循环；65℃，5 s；95℃，50 s。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统分析结果，以Cav-1基因与内参基因灰度值的比值作为Cav-1基因的相对表达水平。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度乙醇对L02 细胞存活率的影响 与对照组比较，不同浓度乙醇组，L02细胞的活性和存活率均下降(均P<0.05)，见表1。乙醇浓度为80 mmol/L时细胞存活率在60%左右，因此本研究使用80 mmol/L的乙醇处理L02细胞建立细胞模型进行后续实验。

表1 对照组和不同浓度乙醇组LO2细胞活性和存活率的比较

2.2 不同浓度红背叶根水提物对乙醇损伤L02 细胞存活率的影响 空白对照组、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL红背叶根组细胞活性和存活率均高于0 mg/mL红背叶根组，6.25 mg/mL、12.5 mg/mL红背叶根组细胞活性和存活率均低于0 mg/mL红背叶根组(均P<0.05)，见表2。本研究选取细胞存活率大于50%的3个红背叶根浓度组(3.125、1.56、0.78mg/mL)进行后续实验。

表2 不同浓度红背叶根对乙醇损伤L02 细胞存活率的影响

2.3 不同浓度红背叶根对乙醇损伤L02 细胞三酰甘油水平的影响 与空白对照组比较，不同浓度红背叶根组三酰甘油水平均升高，且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL红背叶根组三酰甘油水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 不同浓度红背叶根对乙醇损伤L02 细胞三酰甘油水平和Cav-1mRNA相对表达水平的影响(x±s)

2.4 不同浓度红背叶根对乙醇损伤L02 细胞Cav-1 mRNA相对表达水平的影响 与空白对照组比较，不同浓度红背叶根组Cav-1 mRNA表达水平均升高(均P<0.05)，且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL红背叶根组Cav-1 mRNA表达水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

3 讨 论

肝病至今仍是人类沉重的健康负担和五大死亡原因之一，肝病的发病率及其相关死亡率亦无减轻迹象[9]。作为重要的慢性非传染性疾病，脂肪性肝病现已取代病毒性肝炎成为全球第一大肝病，对人类健康和社会发展造成严重危害[10]。我国是肝病大国，在未来几年时间里，脂肪性肝病可能将成为我国肝病防治的主要对象，因此，防治脂肪性肝病的紧迫性和必要性日益凸显[11]。脂肪性肝病按病因可分为酒精性脂肪肝[12]和非酒精性脂肪肝[13-14]。目前用于治疗脂肪性肝病的药物都存在疗效不确切、副作用大等缺点。研发高效、价廉、方便、安全的脂肪性肝病治疗药物有重要意义。

在民间红背叶根用于保肝的历史悠久，疗效确切。本课题组前期研究证实红背叶根对四氯化碳复合因素及酒精性肝纤维化大鼠均有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用[7-8]，并能显著降低肝纤维化大鼠全血黏度指数，改善循环[15]，同时具有抗病毒作用[16]；另外，红背叶根还可以通过抑制TNF-α、白细胞介素6、Toll样受体4等，发挥抗炎、抗氧化应激作用，从而达到防治急性肝损伤的效果[16-22]。本研究结果显示，一定浓度红背叶根水提物可以提高乙醇损伤L02细胞的存活率，提示红背叶根水提物对乙醇损伤的L02细胞有保护作用。

正常肝脏内脂肪含量占5%,当肝内脂肪含量明显增加,肝细胞内出现大量脂肪颗粒时,称脂肪肝。各种原因所致的高脂血症均可伴有肝脂肪浸润,以三酰甘油增高最为常见[23]。研究表明,三酰甘油主要为肝脏提供能量并为新生细胞膜的形成提供不饱和脂肪酸,三酰甘油的聚集是肝再生过程中的重要因素，Cav-1可通过影响三酰甘油的蓄积来参与脂肪代谢进而影响肝再生过程[24]。因此，本研究通过检测三酰甘油及Cav-1 mRNA水平来探讨红背叶根水提物对酒精性脂肪肝模型细胞保护作用的机制。本研究结果显示，不同浓度红背叶根组三酰甘油及Cav-1 mRNA表达水平均高于空白对照组，但0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL红背叶根组三酰甘油、Cav-1 mRNA水平依次降低(P<0.05)。提示红背叶根水提物可能通过降低三酰甘油及Cav-1 mRNA表达水平而发挥保护酒精性脂肪肝的作用，且具有一定的浓度依赖性，Cav-1 可能是红背叶根防治酒精性脂肪肝的作用靶点之一。

综上所述,红背叶根水提物可能通过降低三酰甘油水平及Cav-1 mRNA表达，发挥对酒精性脂肪肝的防治作用。