朴树内生镰刀菌HU0174抗真菌次生代谢产物研究

李晓洁，李丰名，徐良雄，李 玲*，彭永宏,*

1华南师范大学生命科学学院，广州 510631；2惠州学院生命科学学院，惠州 516007

病原真菌侵染是导致采后果蔬腐烂的主要原因之一[1]，不仅造成重大经济损失，部分真菌还会产生真菌毒素，对人的生命安全造成潜在威胁[2]。抗真菌剂的使用可以大大抑制采后果蔬病害的发生和发展[3,4]，然而，越来越多的研究和实践表明杀菌剂的大规模长期使用会导致病原菌耐药性增强[5]。同时，随着人们对健康和环保的意识不断提高，更安全、低毒和低残留的新型天然抗真菌剂的研发越来越受到关注[6]。

镰刀菌属真菌是一类广泛分布的真菌，既可产伏马霉素、T-2毒素等真菌毒素，也可产生物碱、肽、酰胺、萜类、醌类和吡喃酮类等结构多样且具潜在药用价值的代谢产物[7]。在前期植物内生菌的抗菌活性筛选中，发现一株植物内生镰刀菌Fusariumsp.HU0174大米发酵物对柑橘绿霉拮抗活性较好。为此，采用天然产物化学方法对该菌大米发酵物中的次生代谢产物进行分离、鉴定和抗真菌活性评价。

1 材料与方法

1.1 菌种

镰刀菌Fusariumsp.HU0174由惠州学院生命科学学院徐良雄副研究员等于2018年5月分离自惠州市惠东县黄埠圩附近的朴树(CeltissinensisPers.)枝条，经ITS测序比对和形态观察鉴定为镰刀菌属(Fusariumsp.)真菌，现保藏于惠州学院天然产物化学实验室菌种库。植物病原菌柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)和新月弯孢霉(Curvularialunata)由中国科学院华南植物园段学武研究员赠予，黑曲霉(Aspergillusniger)和黄曲霉(A.flavus)由本实验室分离鉴定。

1.2 仪器和试剂

YMP200中压快速纯化制备系统(天津博纳艾杰尔公司)；LC-16P高效液相色谱仪和LC-MS-8040电喷雾质谱仪(日本Shimadzu公司)；Quantum-I核磁共振波谱仪(武汉中科牛津波谱公司)；Bio TOF IIIQ高分辨质谱仪(德国Bruker公司)；IP-digi300/3+数字全自动旋光仪(上海仪迈仪器科技有限公司)。甲醇等分析纯试剂(天津大茂化学试剂厂)；核磁用氘代试剂(美国剑桥公司)；柱层析硅胶(青岛基亿达硅胶试剂有限公司)；C18反相硅胶(日本富士硅化学株式会社)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞典Amersham Biosciences公司)。抗真菌剂百可得(40%)(江苏龙灯化学有限公司)。

1.3 菌株的发酵

挑取活化好的菌株菌丝于3 mL PDB培养基，28 ℃、150 rpm培养3天，制得一级种子液；取2 mL一级种子液转移至200 mL PDB培养基中，相同条件下培养3天，制得二级种子液；取5 mL二级种子液均匀接种于大米固体培养基(含60 g大米和60 g自来水)，28 ℃黑暗静置培养56天。

1.4 提取与分离

发酵物以95%乙醇浸提3次，提取液过滤后浓缩除去乙醇后分别以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。经抗柑橘绿霉活性评价后，在活性追踪的指导下对具活性的乙酸乙酯萃取部位的代谢产物进行分离和纯化。所得乙酸乙酯部(81.2 g)进行正相硅胶(100～200目)柱层析，石油醚-丙酮(100∶0→50∶50)梯度洗脱得流份Fr.1～12。流份Fr.4经HPLC纯化，60%甲醇水洗脱得化合物6(32.6 mg，tR= 19.4 min)。流份Fr.8经中压反相硅胶柱层析，甲醇-水(40%→90%)梯度洗脱得流份Fr.8-1～ Fr.8-20。流份Fr.8-4经HPLC纯化，50%甲醇水洗脱得化合物7(9.4 mg，tR= 12.0 min)；流份Fr.8-20经HPLC纯化，80%甲醇水洗脱得化合物2(12.6 mg，tR= 67.0 min)和5(6.9 mg，tR= 44.0 min)。流份Fr.9经大孔吸附树脂柱层析，40%、60%和90%乙醇-水依次洗脱，得到流份Fr.9-1～6。流份Fr.9-5经HPLC纯化，82%甲醇水洗脱得到化合物3(7.4 mg，tR= 37.2 min)、4(3.8 mg，tR= 30.4 min)和1(6.5 mg，tR= 19.0 min)。

1.5 化合物的结构鉴定

单体化合物以氘代溶剂溶解，采集其核磁共振数据；以色谱甲醇溶解，直接进样采集其电喷雾质谱数据。通过综合分析其波谱数据并比对文献，鉴定化合物结构。

1.6 抗真菌活性测试

采用滤纸片琼脂扩散法评价单体化合物的抗真菌活性。测试真菌孢子以无菌水稀释至约1×106个/mL，均匀涂布于PDA培养基上；化合物以甲醇溶解后加至滤纸片上，每滤纸片载样量为200 μg，以百可得为阳性对照，载样量分别为0.30、0.15、0.078、0.039 μg，甲醇为阴性对照。定期观察测试菌生长情况，并测量抑菌圈半径。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

HR-ESI-MS结果显示该化合物的分子式为C43H69O11N7。其13C NMR谱(氘代甲醇为溶剂)检测到43个碳信号，其中包括8个酯羰基碳信号(δC177.7、176.0、175.3、174.1、173.4、173.2、173.0、172.1)；6个邻位或对位取代苯环的碳信号[δC157.4、131.4(2C)、128.7、116.3(2C)]；8个连氧或氮的碳信号(δC77.4、68.3、60.2、59.7、55.8、55.0、51.6、51.1)。1H NMR谱显示该化合物存在对位取代苯环上质子信号[δH7.04(2H，d，J= 8.6 Hz)、6.70(2H，d，J= 8.6 Hz)]；存在8个连在杂原子上的质子信号[δH4.83(1H，m)，4.58(1H，t，J= 7.5 Hz)，4.33(1H，d，J= 7.4 Hz)，4.31(1H，d，J= 8.1 Hz)，4.22(1H，t，J= 6.6 Hz)，4.18(1H，d，J= 7.4 Hz)，4.14(1H，m)，3.85(1H，d，J= 8.4 Hz)]，7个甲基质子信号[δH1.46(3H，d，J= 7.4 Hz)，1.42(3H，d，J= 6.9 Hz)，1.33(3H，s)，1.01(3H，d，J= 6.7 Hz)，0.92(3H，t，J= 6.5 Hz)，0.88(3H，d，J= 6.9 Hz)，0.84(3H，t，J= 7.4 Hz，3H)]，此外，在δH1.31～1.20存在12个长链烷烃质子信号。结合上述13C NMR谱和1H NMR谱分析结果，推测该化合物可能是由6个氨基酸与1个脂肪酸链组成的寡酯肽。环肽薄层层析特征显色结果还显示该化合物为环肽[8]。通过对比化合物1与同时分离自该菌的acuminatum B(3)的13C NMR谱数据发现，两者氨基酸残基和酯羰基相关碳信号基本一致，但化合物1在δC30.6附近比acuminatum B少2个碳信号，δH1.31～1.20区间中也少4个质子信号，且HR-ESI-MS显示其分子量比acuminatum B少28 Da。此外，采用氘代DMSO采集的1D NMR数据(见表1)和1H-1H COSY、HMBC相关谱(见图2)进一步验证了上述判断，说明化合物1的酯基部分为3-羟基-4-甲基-十二烷酸(3-hydroxy-4-methyldodecanoic acid，HMDA)。基于其与acuminatums A～C(2～4)具有相同的生源，以及相近的比旋光度值，推测它们的立体构型相同，化合物1化学结构如图1所示，是一个新的acuminatum类衍生物，命名为acuminatum D。化合物1的详细结构鉴定原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

图1 化合物1～7的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

图2 化合物1的1H-1H COSY和关键HMBC相关Fig.2 1H-1H COSY and key HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H(400 MHz)和13C(100 MHz)NMR数据

续表1(Continued Tab.1)

922[M+Cl]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)：D-allo-Thr：δ4.30(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，4.16(1H，m，H-3)，1.29(3H，d，J= 6.3 Hz，H-4)；L-Ala-1：δ4.35(1H，q，J= 7.0 Hz，H-2)，1.40(3H，d，J= 7.0 Hz，H-3)；D-Ala-2：δ4.15(1H，q，J= 7.3 Hz，H-2)，1.44(3H，d，J= 7.3 Hz，H-3)；L-Gln：δ4.21(1H，t，J= 7.6 Hz，H-2)，2.22(2H，m，H-4)，2.05(2H，m，H-3)；D-Tyr：δ7.02(2H，d，J= 8.5 Hz，H-5，9)，6.68(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，8)，4.55(1H，t，J= 7.6 Hz，H-2)，2.98(1H，dd，J= 13.6，7.6 Hz，H-3)，2.90(1H，dd，J= 13.6，7.6 Hz，H-3)；L-Leu：δ4.30(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，1.76(2H，m，H-3)，1.44(1H，m，H-4)，0.90(3H，d，J= 6.4 Hz，H-5)，0.83(3H，d，J= 6.9 Hz，4-CH3)；HMTA：δ4.77(1H，m，H-3)，2.59(1H，m，H-2)，2.53(1H，m，H-2)，1.77(1H，m，H-4)，1.59(1H，m，H-5)，1.27～1.23(16H，m，H-6～13)，1.10(1H，m，H-5)，0.98(3H，d，J= 6.8 Hz，4-CH3)，0.89(3H，t，J= 7.1 Hz，H-14)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：D-allo-Thr：δ173.2(C-1)，68.4(C-3)，60.4(C-2)，20.9(C-4)；L-Ala-1：δ176.0(C-1)，51.1(C-2)，17.6(C-3)；L-Ala-2：δ175.3(C-1)，51.6(C-2)，17.1(C-3)；L-Gln：δ177.8(CONH2)，173.8(C-1)，54.9(C-2)，32.7(C-4)，27.8(C-3)；D-Tyr：δ174.0(C-1)，157.3(C-7)，131.4(C-5，9)，128.7(C-4)，116.2(C-6，8)，55.7(C-2)，38.5(C-3)；L-Leu：δ172.9(C-1)，53.5(C-2)，40.7(C-3)，25.7(C-4)，23.0(4-CH3)，22.5(C-5)；HMTA：δ172.0(C-1)，77.4(C-3)，39.4(C-2)，36.1(C-4)，33.5(C-5)，33.1(C-12)，30.9(C-7)，30.8(C-8)，30.8(C-9)，30.7(C-10)，30.5(C-11)，27.2(C-6)，23.7(C-13)，16.0(4-CH3)，14.4(C-14)。对比文献[9-12]，化合物2鉴定为acuminatum A。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z784[M+H]+，806[M+Na]+，782[M-H]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)Me Phe-1/2/3：δ7.27(4H，d，J= 4.2 Hz，H-5，6，8，9)，7.20(1H，dt，J= 8.4，4.2 Hz，H-7)，5.80(1H，dd，J= 12.8，4.6 Hz，H-2)，3.41(1H，dd，J= 14.9，4.6 Hz，H-3)，3.16(3H，s，H-10)，3.06(1H，dd，J= 14.9，12.8 Hz，H-3)，Leu-1/2/3：δ4.87(1H，m，H-2′)，1.81(1H，m，H-3′)，0.86(3H，d，J= 6.7 Hz，H-4′)，0.29(3H，d，J= 6.7 Hz，H-5′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：Me Phe-1/2/3：δ173.2(C-1)，138.0(C-4)，129.8(C-5、6、8、9)，128.0(C-1)，57.9(C-2)，35.4(C-3)，31.2(C-10)。对比文献[15]，化合物5鉴定为白僵菌素。

化合物6白色固体；ESI-MS：m/z262[M+H]+，284[M+Na]+，260[M-H]-，557[2M+Cl]-。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ7.33(1H，m，H-14)，7.33(1H，m，H-15)，7.32(1H，m，H-13)，7.14(1H，d，J= 3.4 Hz，H-16)，7.13(1H，d，J= 2.3 Hz，H-12)，4.40(1H，t，J= 4.5 Hz，H-3)，3.28(1H，dd，J= 18.6，4.5 Hz，H-10)，3.20(1H，dd，J= 18.6，4.5 Hz，H-10)，3.02(3H，s，H-17)，2.97(3H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，2.31(1H，m，H-7)，0.85(1H，d，J= 7.1 Hz，H-8)，0.77(1H，d，J= 6.5 Hz，H-9)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ167.4(C-2)，165.7(C-5)，134.3(C-11)，129.9(C-12)，129.9(C-16)，129.4(C-13)，129.4(C-15)，128.3(C-14)，81.4(C-6)，62.9(C-3)，37.2(C-10)，32.6(C-17)，29.8(C-7)，18.7(C-8)，15.3(C-9)。对比文献[16]，化合物6鉴定为白僵菌酮。

化合物7黄色粉末；ESI-MS：m/z160[M-H]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，dd，J=7.1，1.7 Hz，H-4)，7.94(1H，s，H-2)，7.43(1H，dd，J= 7.1，1.6 Hz，H-7)，7.17(1H，dd，J= 7.1，1.4 Hz，H-5)，7.17(1H，dd，J= 7.1，1.4 Hz，H-6)；13C NMR：(100 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-8)，138.2(C-7a)，133.4(C-2)，127.6(C-3a)，123.6(C-6)，122.3(C-5)，122.0(C-4)，112.9(C-7)，108.8(C-3)。对比文献[17]，化合物7鉴定为吲哚-3-羧酸。

2.2 抗真菌活性

滤纸片琼脂扩散法评价结果显示(见表2)，载样量为200 μg时，化合物acuminatums A～D(1～4)对柑橘绿霉和新月弯孢霉显示出较强的抑制效果，而对黑曲霉和黄曲霉无明显抑制活性，其余化合物对所有测试的真菌均无明显抑制作用。

表2 化合物1～4的抗真菌活性(抑菌圈半径，mm)

3 讨论

环肽类微生物源抗真菌剂具有易降解、低残留的特点，其中纳他霉素(natamycin)已经作为天然抑菌剂在多个国家和地区广泛应用食品领域。环酯肽类化合物具有抗菌、抗肿瘤等生物活性[18]，越来越引起人们的广泛关注。环酯肽类化合物在抗细菌活性方面研究较为成熟，有些已经用于临床，其中包括抗生素粘菌素(colistin)和达托霉素(daptomycin)可分别用于治疗多重耐药性革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引起是疾病[19,20]。在抗真菌活性方面研究相对较少，其中包括clavariopsins A和B对白色念珠菌、烟曲霉和黑曲霉表现出抑制作用，MIC值分别为8、4和16 μg/mL[20,21]；verlamelins A和B对芒果炭疽病菌表现较强的抑制作用，其MIC值分别为4.9和9.8 μg/mL[22]。有研究表明acuminatum B、C对苹果黑星菌、苹果链核盘菌和水稻旋胞腔菌表现出很强的拮抗活性[13]，且表现出相同的MIC值，分别为1、1、10 μg/mL，同时acuminatum B同系物fusaripeptide A对白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌以及烟曲霉都表现很强的抑制作用，IC50为0.11～0.24 μM，略低于两性霉素B[23]。

本研究从朴树内生镰刀菌Fusariumsp.HU0174大米发酵物的乙酸乙酯部位分离鉴定了7个化合物，包括5个环酯肽和2个杂环类化合物，其中化合物1为新化合物，丰富了镰刀菌次生代谢产物的多样性。抗真菌活性结果显示，环酯肽类化合物acuminatum A～D(1～4)在200 μg时对柑橘绿霉和新月弯孢霉有抑制作用，但是对黑曲霉和黄曲霉均无抑制活性，说明化合物acuminatum类环酯肽的真菌拮抗活性具有较强的特异性，初步阐明了镰刀菌Fusariumsp.HU0174的抗真菌活性物质基础，对新型微生物源的抗真菌剂的研发具有一定的参考价值。