鲤RNF2基因的克隆、组织表达与生物信息学分析

刘变枝， 李海洁， 郭家鸿， 郭朝辉， 冯建新， 杨雪冰， 张娇， 李明

(1.河南农业大学动物科技学院，河南 郑州 450046； 2.河南省水产科学研究院水产养殖与遗传育种研究室，河南 郑州 450044； 3.河南省水产技术推广站，河南 郑州 450008)

天然免疫系统是生物体抵抗病原侵袭的第一道防线，其免疫稳态的维持取决于机体免疫反应强度和持续时间，免疫不足加重病原体的侵袭，免疫过度活化则引发自身免疫性疾病[1]。因此，机体天然免疫过程需受到精准调控。泛素化修饰是真核生物中广泛存在的一种蛋白质翻译后修饰[2]，由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶(E3s)或去泛素化酶共同作用完成，可在不同信号通路水平调控模式识别受体(Pattern recognizing receptors，PRRs)介导的天然免疫反应。在这一过程中，E3连接酶起到关键作用，是泛素分子被精准耦联到特定蛋白的关键以及底物特异性的直接决定者[3]。RING E3s是一类含有RING(Really interesting new gene)结构域的E3泛素连接酶，通过RING结构域招募E2泛素结合酶进而介导泛素分子从E2转移至底物进行泛素化修饰[4]。RNF(Ring finger protein)家族是RING E3中的一大类，目前越来越多的RNF家族成员被证明在宿主天然免疫中起调控作用[5-6]，故挖掘RNF家族中新的天然免疫调控分子，解析其在天然免疫中的泛素化调控功能，可有效丰富PRRs介导的天然免疫反应调控机制，为抗病毒药物及治疗靶点的开发提供理论基础。

RNF2是RNF家族的一员，为多梳基因家族(Polycomb group，PcG)成员PCR1复合体(Polycomb repressive complex1，PCRC1)的核心组分和重要催化亚基，在发育、肿瘤发生等方面起表观调控作用[7-8]。最新研究表明，RNF2通过泛素化负调控IFN-I(Interferon-I)通路抗病毒反应[9]，在NF-κB免疫信号通路等方面也发挥作用[10]，提示RNF2在机体抗病毒精准调控中可能发挥重要的负反馈作用。鲤(Cyprinuscarpio)是中国内陆重要的经济养殖鱼类，近年来，细菌、病毒等疾病已成为制约中国鲤产业发展的重要因素[11]。深入研究PRRs介导的鲤天然免疫反应调控机制，将为鲤疾病的防治提供有效理论基础。因此，本研究以鲤为研究对象，克隆RNF2基因序列、检测其在鲤各组织中的表达，为进一步研究该基因的功能及其在鲤天然免疫防御中的作用研奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和主要试剂

试验鱼(规格：(448.33±5.61)g，表观健康)取自河南省水产研究院黄河鲤遗传育种培育基地。试验鱼运回后放置河南农业大学文化路校区动物房内的圆形养殖缸内暂养(直径2 m，高0.75 m；有效水体积：1.80 m3)，暂养水温29～32 ℃。暂养5 d后解剖鱼体，分别取肾脏、鳃、皮肤、前肠、中肠、后肠、脾脏、心脏、脑、头肾、肝脏和肌肉组织，经冷藏的DEPC水冲洗后迅速放入无RNA酶冷冻管，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

主要试剂：Trizol 试剂(TaKaRa 公司)、PrimerScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa 公司)、PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0 plus dye)(TaKaRa 公司)、DL5000 DNA Maker(北京擎科生物科技有限公司)、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒(天根生化科技有限公司)、pMD-19T Vector(TaKaRa 公司)、E.coliDH5α感受态细胞(TransGen Biotech)等。

1.2 引物设计及合成

据NCBI网站发布的鲤RNF2基因预测序列，以β-actin为内参基因，利用NCBI primer-BLAST软件设计基因克隆及qRT-PCR引物，引物信息见表1。引物由河南尚亚生物技术有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 RNA提取及反转录

Trizol法提取鲤各组织总RNA，评价其纯度、浓度、完整性。利用PrimeScript试剂盒合成cDNA第一链，后据实时荧光定量试剂盒要求将cDNA稀释成相同浓度，-20 ℃保存备用。

1.4 鲤RNF2基因的克隆及测序

以肾脏组织cDNA为模板进行鲤RNF2基因CDS(Coding sequence)区序列PCR扩增。反应体系如下(50 μL)：模板cDNA(300 ng·μL-1) 1 μL，RNF2-F1(10 μmol·L-1) 1 μL，RNF2-R1(10 μmol·L-1) 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O补至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，32个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收试剂盒回收目的条带，连接pMD-19T载体，16 ℃过夜。连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，涂板后挑取单克隆接种LB液体培养基中，置于37 ℃摇床180 r·min-1振荡培养12～16 h后，提取质粒，经PCR检测鉴定正确后送至河南尚亚生物技术有限公司进行测序。

1.5 鲤RNF2生物信息学分析

应用Megalign、Mega 7.0软件和BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序对鲤RNF2基因核苷酸序列做同源性比较，绘制系统进化树。利用ProtParm在线程序(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析鲤RNF2蛋白理化参数；采用SignalP在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析RNF2蛋白信号肽的功能；使用TMHMM在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Expasy Protscale在线程序(http://web.expasy.org/protscale /l)进行RNF2蛋白质跨膜区预测和疏水性分析；使用NCBI的Conserved Domain Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析RNF2蛋白结构域；通过PSORT II Prediction在线网站(https://psort.hgc.jp/form2.html)预测RNF2蛋白的亚细胞定位；利用SOPMA在线程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Phyre2在线软件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)及SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分析RNF2蛋白二级和三级结构；利用UbiBrowser在线程序(http://ubibrowser.ncpsb.org/ubibrowser/)进行RNF2蛋白泛素化底物预测。

1.6 鲤RNF2基因在鲤不同组织中的表达谱分析

qRT-PCR反应体系：TB Green®PreminExTaqRMⅡ 5 μL、上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL、cDNA(300 ng·μL-1)1 μL、ddH2O 补足至10 μL。在CFX96实时荧光定量PCR仪上进行反应，扩增程序采用三步法：95 ℃，5 min；1个循环。95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共38个循环。95 ℃，10 s;65 ℃，60 s；97 ℃，1 s；1个循环。37 ℃,30 s。每个组织设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复，根据荧光定量所得到的Ct值，采用2-△△Ct法对数据进行分析，GraphPad Prism 7.0软件作图。

1.7 数据分析

数据以“平均值±标准误”表示，利用SPSS 25.0软件进行分析处理。数据经齐性检验后(Homogeneity of variances)，进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，若数据差异显著(P<0.05)则进行Duncan’ s多重比较(Duncan’ s multiple range test)。

2 结果与分析

2.1 鲤RNF2基因的克隆

以肾脏组织cDNA为模板进行PCR扩增获得大小约为1 011 bp的片段(图1)。测序得到1 011 bp核苷酸序列，包含鲤RNF2基因的完整开放阅读框(ORF)，编码336个氨基酸(图2)，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，A、G、C、T分别占29.28%、27.50%、26.90%、16.32%。

图1 鲤RNF2基因PCR扩增结果

图2 鲤RNF2基因CDS区及相应氨基酸序列

2.2 鲤RNF2基因的同源性比较

由图3和图4可知，鲤RNF2基因核苷酸序列与鲫(Carassiusauratus)、斑马鱼(Daniorerio)、金头鲷(Sparusaurata)、海洋青鳉鱼(Oryziasmelastigma)、鳕鱼(Gadusmorhua)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、尖尾娇鹟(Chiroxiphialanceolata)、小鼠(Musmusculus)、智人(Homosapiens)的同源性分别为98.2%、93.1%、78.0%、79.2%、79.2%、73.9%、78.1%、72.7%、72.7%。系统进化树分析结果显示鲤与鲫、斑马鱼的亲缘关系最近，与智人、小鼠的遗传距离较远。

图3 鲤RNF2核苷酸序列与其他已知物种核苷酸序列的比对

图4 鲤RNF2基因系统进化树

2.3 鲤RNF2蛋白的理化性质

由表2 和表3 可知，鲤RNF2蛋白相对分子质量为37.44 kD，理论等电点(pI)为6.28，属酸性蛋白；该蛋白共有336个氨基酸，负电荷残基(Asp+Glu)和正电荷的残基(Arg+Lys)总数分别为44和40，分子式为C1611H2590N470O522S17，原子总数为5 210；编码氨基酸不稳定指数为36.75，为稳定蛋白；脂肪系数为74.97%；亲疏水性分析发现，RNF2蛋白第76位异亮氨酸疏水性最强(1 911)，第121位谷氨酸和122位丙氨酸亲水性最强(-2 744)，平均亲水性为-0.631，为亲水性蛋白(图5)。

表2 鲤RNF2蛋白的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of RNF2 protein in Cyprinus carpio

表3 RNF2蛋白一级结构信息Table 3 Primary structure information of RNF2 protein

图5 鲤RNF2蛋白疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of Cyprinus carpio RNF2 protein

2.4 鲤RNF2蛋白跨膜结构和信号肽预测

图6和图7可知，RNF2蛋白不含跨膜结构和信号肽，不属于跨膜蛋白和分泌蛋白。

图6 鲤RNF2蛋白跨膜结构预测Fig.6 HTransmembrane structure prediction of RNF2 protein in Cyprinus carpio

图7 鲤RNF2蛋白信号肽预测Fig.7 Signal peptide prediction of RNF2 protein

2.5 鲤RNF2蛋白亚细胞定位和功能结构域分析

鲤RNF2蛋白亚细胞定位预测结果显示该蛋白在细胞核、线粒体、细胞质和过氧化物酶体上的比例分别为52.2%、26.1%、17.4%和4.3%，表明该蛋白主要位于细胞核内。由图8可知，该蛋白含有RING-HC_RING2结构域和RAWUL_RING2结构域，分别位于47～93位和225～330位氨基酸处。由图9可知，RING-HC_RING2结构域在鲤鱼、斑马鱼、小鼠和人中完全一致(图9A)，RAWUL_RING2结构域在鲤鱼与斑马鱼中存在一个氨基酸差异，与小鼠和人则存在较多氨基酸的变异(图9B)。

A：RING-HC_RING2结构域；B：RAWUL_RING2结构域。

2.6 鲤RNF2蛋白二级结构和三级结构

经SOPMA在线程序预测可知鲤RNF2蛋白二级结构含有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲，分别占35.12%、8.63%、0.89%和55.36%(图10)。利用Pymol软件基于模板“c2h0dB”进行预测，结果显示鲤RNF2蛋白三级结构以无规则卷曲为主(置信度：99.9%，%i.d.为99%)，与二级结构预测结果一致(图11A)。利用SWISS-MODEL基于模板“2ckl.1.B”对鲤RNF2蛋白进行3D建模，结果与Pymol软件预测结果一致(Seq identity为96.23%，图11B)。

注：h，α-螺旋；e，延伸链；t，β-转角；c，无规则卷曲

A：由Pymol预测所得RNF2蛋白三级结构；B：由SWISS-MODEL预测所得RNF2蛋白三级结构。

2.7 鲤RNF2底物作用蛋白预测

由表4可知，鲤RNF2蛋白与底物IRF4(Interferon regulatory factor 4)、TP53(Tumor protein p53)、HIST2H2AC(组蛋白H2A型2-C型)、H3F3B(组蛋白H3.3)、HIST3H3(组蛋白H3.1t)存在相互作用的置信度较高，分别为0.799、0.797、0.775、0.771、0.771(表4)。

表4 鲤RNF2蛋白泛素化底物预测结果Table 4 Ubiquitination substrate of carp RNF2 protein

2.8 鲤RNF2基因的组织表达分析

由图12可知，鲤RNF2基因在鲤各组织中均有表达，以肌肉组织中显著最高(P<0.05)；其次是头肾和肝脏，随后是脑、心脏、前肠、脾脏、中肠、后肠、皮肤、鳃、肾脏(图12)。

1.肌肉;2.头肾;3.肝脏;4.脑;5.心脏;6.前肠;7.脾脏;8.中肠;9.后肠;10皮肤;11.鳃;12.肾脏。不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

哺乳动物中的研究表明，RNF2具有典型的RING 结构域，可单泛素化组蛋白H2A119位赖氨酸残基或经多聚泛素化介导TP53降解调控细胞增殖、凋亡、肿瘤迁移等[12-14]。研究还发现RNF2可通过STAT1(Signal transducer and activator of transcription1，STAT1)进行K33位连接的多聚泛素化来修饰STAT1的DNA结合结构域K379位点进而促进STAT1与ISRE(Interferon stimulate response element)的解离，负向调控STAT1介导的ISGs转录表达[9]。现有研究表明，鱼类中同样存在由STAT1、STAT2和IRF9共同组成的ISGR3(IFN-stimulated gene factor 3，ISGR3)转录因子复合体[15-18]。斜带石斑鱼(Orange-spotted grouper,epinepheluscoioides)中过表达STAT1a显著上调ISGs的表达[15]。鲫鱼(Gibel carp，Carassiusauratus)中STAT1被证明参与IFNa引发的ISG诱导[16]。大西洋鲑(Atlantic salmon,Salmosalar)中重组蛋白IFNa1刺激下STAT1a磷酸化进行核位移[17]。上述研究表明，鱼类STAT1在IFN-I信号通路抗病毒反应中同样重要，研究RNF2泛素化修饰调控STAT1功能的机制对鱼类抗病毒反应具有重要意义。

与哺乳动物相比，鱼类因体外受精、胚胎发育过程透明可视、RNF2缺失下胚胎可正常形成原肠等而被视为研究RNF2功能的理想对象。但目前鱼类中有关RNF2功能的研究仅限于突变RNF2后对斑马鱼胚胎发育的影响[19-20]，尚无RNF2对鱼类天然免疫反应调控的报道。本研究克隆得到全长1 011 bp、编码336个氨基酸的鲤RNF2基因完整CDS区。核苷酸序列比对分析发现该基因与鲫RNF2基因具有较高的同源性。生物信息学分析表明，鲤RNF2蛋白属稳定的、亲水性蛋白，不含跨膜结构域和信号肽，不属于跨膜蛋白和分泌蛋白。亚细胞定位预测显示鲤RNF2基因在细胞核中的占比高达52.2%，推测鲤该基因主要分布在细胞核中，这与SIMON等[21]的研究结果相一致。

结构域分析发现，RNF2蛋白含有RING-HC_RING2结构域，属典型的C3HC4型RING结构蛋白，符合动物中RNF2蛋白的典型特征[22-23]。结构域相似性分析发现鲤、斑马鱼、小鼠、智人RNF2蛋白的RING结构域蛋白序列完全一致，该结构域从鱼到人演化中的高度保守性说明该结构域有重要的生理功能。泛素化底物预测结果表明鲤RNF2蛋白与TP53、组蛋白H2A亚型HIST2H2AC、组蛋白H3亚型H3F3B及HIST3H的相互作用置信度高，这与哺乳动物及斑马鱼中报道的RNF2蛋白的功能作用相一致[19-20]。

底物预测结果还显示鲤RNF2蛋白与IRF4存在高相互作用置信度。IRF4属IRF家族成员，既是调节免疫细胞分化和成熟的关键因子[24-26]，也是介导免疫反应的负调控因子，可直接结合ISRE元件上调ISG60的表达[27]，与IRF5竞争并协同MyD88负调控TLR介导的炎性反应[28]或通过抑制TRAF6(Tumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor6)和RICK(Receptorinteractingserine-threoninekinase)Lys63位的多聚泛素化下调NOD介导的结肠炎症反应[29]。鱼类中，除LI等[30]报道STAT6和c-Rel(amemberoftheNF-κBtranscriptionfactorfamily)调控IRF4表达外，鲜有其他基因对IRF4调控的报道。本研究预测到IRF4为RNF2作用底物，但RNF2与IRF4是否存在作用及其相互作用关系在鱼类抗病毒反应中的功能尚需由实验进行验证。

本研究发现RNF2基因在鲤不同组织中均有表达，肌肉、头肾和肝脏中表达量最高。鲤鱼头肾是重要的免疫器官，RNF2在头肾中的高表达进一步提示其可能在鱼类免疫反应中起到重要作用。

4 结论

本研究成功克隆得到鲤RNF2基因CDS编码区序列1 011 bp，编码336个氨基酸。该基因具有高度保守性，与鲫亲缘关系最为接近。鲤RNF2蛋白属于酸性、稳定、亲水性蛋白，含有RING-HC_RING2保守结构域，具E3泛素连接酶RING finger家族一般结构域特征；不含跨膜结构和信号肽，不属于跨膜蛋白和分泌蛋白，主要分布在细胞核中。三级结构以无规则卷曲为主，与底物TP53、IRF4、HIST2H2AC、H3F3B、HIST3H3相互作用的置信度较高；鲤RNF2基因在鲤肌肉、头肾、肝脏中表达最高。