镉胁迫对苗期小麦镉吸收及其根际细菌群落的影响

王宁， 姚晨， 贾瑞， 李本银， 马诗毓， 马闯， 张世敏， 李烜桢

(1.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002；2.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002；3.河南省农业科学院，河南 郑州 450002；4.郑州轻工业大学材料与化学工程学院，河南 郑州 450002)

镉(Cd)被农作物吸收后通过食物链传递,对人和动物的生命健康构成严重威胁，直接影响中国的粮食安全。据《全国土壤污染状况调查公报》显示，中国土壤污染总超标率达16.1%，耕地土壤重金属点位超标率19.4%，Cd点位超标率7.0%，占无机污染物之首[1]。植物对Cd的吸收依赖于Cd在土壤中的形态，了解Cd在土壤中的转化过程，是治理Cd污染的重要前提。土壤微生物直接或间接参与土壤中重金属的活化和固定，同时在植株根系生长发育过程中起着十分重要的作用，对土壤有机物质的降解转化、土壤肥力的保持等均有较大影响[2]。土壤微生物通过引起土壤pH值降低、氧化还原电位改变及螯合剂释放等[3]使Cd活化，而Cd有效性降低则通过微生物介导的生物沉淀或吸附等过程实现[4-5]。另外，植物根系分泌物、代谢物提供各种营养和能量作用于微生物，进而以植物特有的方式影响微生物种群[6]。土壤微生物群落是指多种因素作用下，一定面积土壤中的细菌、真菌等构成的生物群体，其种群数量、区系组成和生物活性等与土壤类型、气候和植被等密切相关，同时也受重金属胁迫的影响[7-9]。因此，在面对耕地资源短缺及Cd污染严重的情况下，了解根系微生物参与Cd在土壤中转化及植物根系吸收的机制十分重要。目前，关于Cd胁迫下水稻的根际微生物群落结构研究较多，而对小麦的研究甚少。HOU等[10]发现，Cd胁迫可以减少水稻根际土壤细菌的多样性并改变其菌落结构，且在水稻根际高度富集了多种直接或间接活化Cd的菌种。因此，本研究采用盆栽方式种植小麦，利用16S rRNA基因扩增子测序技术，研究Cd胁迫对苗期小麦的生长和Cd吸收，以及对根际土壤细菌群落特征的影响，以期了解Cd胁迫下小麦吸收和积累Cd与根际细菌群落组成的关系，为治理土壤Cd污染提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试土壤和小麦品种

供试土壤采自河南农业大学科教园区，自然风干2.0 mm筛网过筛。土壤pH值8.5，土壤Cd含量为0.1 mg·kg-1，低于《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618—2018)[11]筛选值(pH值>7.5，Cd含量<0.6 mg·kg-1)。供试小麦种子品种为豫保1号，购于河南秋乐种业科技股份有限公司。

1.2 盆栽试验

本研究模拟河南省某地受电池厂废液污染的Cd含量2.0 mg·kg-1的土壤现状，在口径210 mm的塑料花盆中加入供试土壤和CdCl2(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，采用干混法混匀至土壤中Cd含量2.0 mg·kg-1，总质量1 kg。设置2个处理，对照处理CK为供试土壤，土壤Cd含量为0.1 mg·kg-1；T处理为外源Cd胁迫土壤，土壤Cd含量为2.0 mg·kg-1，每个处理进行4个平行试验。

小麦种子在25 ℃下避光育种，3 d后移栽至花盆中，水分含量为土壤田间最大持水量的60%，苗期50 d后收获小麦和根际土壤。将小麦样品用高通量组织研磨仪(TL2020，北京鼎昊源科技有限公司)粉碎，采用四分法取样,测小麦地上部、地下部Cd含量[12]。土壤样品一部分于-80 ℃保存，用于细菌16S rRNA基因高通量测序分析；另一部分自然风干保存，用于理化性质分析。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤及小麦理化指标测定 小麦干质量测定：将种植50 d的小麦烘干至恒质量放置电子天秤(JEA502，上海浦春计量仪器有限公司)称质量；土壤pH值测定：参照李强[13]的方法对土壤进行处理，用pH计(雷磁PHS-25，上海仪电科学仪器股份有限公司)进行测定；土壤有效态Cd含量测定：采用DTPA浸提法[14]，用E-Max荧光重金属分析仪测定(E-max500，美国XOS公司)；小麦Cd含量测定：将种植50 d的小麦烘干经研磨仪粉碎后，用E-Max荧光重金属分析仪测定。

小麦地上部Cd吸收总量=小麦地上部Cd含量×地上部生物量

(1)

小麦地下部Cd吸收总量=小麦地下部Cd含量×地下部生物量

(2)

重金属富集系数(bioaccumulation factor,BCF)=植物中重金属含量/土壤中重金属含量

(3)

重金属转移系数(transfer factor,TF)=地上部重金属含量/地下部重金属含量

(4)

1.3.2 土壤总DNA的提取、PCR扩增及Illumina测序 将种植50 d的小麦根际土壤DNA采用土壤DNA提取试剂盒(PowerSoil®DNA Isolation kit，德国MO BIO公司)提取。PCR 扩增采用16S rRNA基因 V3-V4 可变区的细菌通用引物341F/806R进行目的基因扩增。将PCR 扩增后的目的条带回收，送至北京诺禾致源科技股份有限公司利用 Illumina NovaSeq 测序平台进行16S rRNA基因序列测定。

1.3.3 高通量测序分析 根据各样本所扩增的16S区域特点，构建小片段文库，基于Illumina NovaSeq测序平台对该文库进行双末端测序。测序得到的原始数据进行质量控制，再将得到的有效数据以序列97%的相似度划分为多个操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，基于OTUs水平绘制稀疏曲线并进行物种注释及分析物种丰度指数(ACE和Chao1指数)、多样性指数(Shannon指数)和非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)。

1.4 数据处理

所得数据采用GraphPad Prism 8、Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对苗期小麦干质量的影响

Cd胁迫对苗期小麦干质量的影响如图1所示。经过50 d的培养，T处理显著降低了小麦地上部和地下部干质量(P<0.05)，分别由1.5、0.7 g降低至1.4、0.5 g，分别降低了7.46%和28.73%，表明Cd胁迫可抑制小麦的生长。

注：小写字母标注的统计分析是针对相同取样部位不同处理之间，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 Cd胁迫对苗期小麦Cd吸收的影响

Cd胁迫对种植50 d的苗期小麦Cd吸收的影响如图2和图3所示。Cd胁迫下小麦地下部、地上部Cd含量和吸收总量较对照均显著增大(P<0.05)。T处理中小麦地上部和地下部Cd含量分别达到3.7、6.3 mg·kg-1，为CK的16.3倍和10.5倍；地上部和地下部Cd吸收总量分别达到5.1、3.0 μg，为CK的15.2倍和7.6倍。此外，CK和T处理中地下部Cd含量分别是地上部的2.7倍和1.7倍，表明地下部较地上部积累Cd含量更高。T处理中地下部和地上部BCF较CK显著降低(P<0.05)，分别由5.2和2.0降至3.0和1.8，降低了41.4%和9.0%，而TF较对照由0.4提高至0.6，升高了48.61%。这表明外源Cd的胁迫会减弱小麦的BCF，但增强小麦的TF。

图2 Cd胁迫下小麦Cd含量(A)及吸收总量(B)

注：小写字母标注的统计分析是针对不同处理间，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 Cd胁迫对苗期小麦根际pH值和有效Cd含量的影响

Cd胁迫对种植50 d的苗期小麦根际土壤pH值和有效Cd含量的影响如图4所示。外源Cd明显使得土壤有效Cd的含量增加，且使土壤pH值有下降趋势。T处理中pH值较CK由8.6降至8.5，但有效Cd含量较CK显著增加(P<0.05)，由0.06 mg·kg-1增加至1.7 mg·kg-1，增加了29.7倍。

图4 Cd胁迫下小麦根际土壤pH值(A)及有效Cd含量(B)

2.4 Cd胁迫对苗期小麦根际细菌群落多样性及结构的影响

基于Illumina Nova 测序平台，经PCR-free文库构建后，进行双末端测序和片段拼接。平均每样品测得80 564条序列，经过质控平均得到74 580条有效数据，质控有效数据量达49 016，质控有效率达61.9%。以序列97%的相似度划分，共得到3 332个OTUs。稀疏曲线是比较测序数量不同的样本物种的丰富度并评估样本的取样大小是否合理，如图5所示，该曲线趋于平缓，说明测序深度已经基本覆盖到样品的所有物种，测序数据量足以反映样品中的物种多样性。

图5 OTU稀疏曲线

对土壤细菌群落的Alpha多样性指数进行分析结果如图6所示。T处理菌群丰度指数(Ace和 Chao1指数)较CK分别由2 624和2 568增至2 789和2 732，分别增大了5.9%和6.0%，这表明Cd胁迫可以使根际土壤细菌物种数量增多。此外，T处理菌群Shannon指数较CK增大了0.6%，这表明Cd胁迫下，根际土壤细菌物种有更大的均匀度，提高了土壤细菌群落的多样性。

图6 Cd胁迫下小麦根际土壤细菌丰度指数和多样性指数

NMDS是基于Bray-Curtis距离来进行分析的非线性模型，根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在二维平面上。如果样本的群落组成越相似，则在NMDS图中的距离越接近，其中Stress值代表细菌菌落相似性分离程度，判断该图是否可以准确反映数据排序的真实分布，Stress值要求小于0.1。为了能够直观地看出Cd胁迫下土壤细菌群落组成结构的差异，绘制基于OTU水平的NMDS分析图，其Stress值为0.011。如图7所示，T处理分布在第一、二象限，而CK分布在第三、四象限，各个处理有较好的聚集性，因此，Cd胁迫可以改变土壤细菌群落结构。

图7 不同Cd处理下小麦根际土壤细菌群落NMDS分析

通过与数据库Silva132比对，进行物种注释，结果如图8所示。选取门水平相对丰度排名前10的物种生成物种相对丰度柱形堆叠图，观察CK和T处理在门水平相对丰度较高的物种及比例。不同处理间各物种相对丰度无明显变化，相对丰度最大的3个门依次为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)。与CK相比，T处理中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度有所增加，而放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度有所减少。

在属水平上，选取相对丰度排列前30位的菌属进行分析，发现各处理共有相对丰度>1%的菌属分别是鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、unidentified_Acidobacteria、溶杆菌属(Lysobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、Gaiella、单胞菌属(Arenimonas)、Dongia、unidentified_Gammaproteobacteria。与对照相比，鞘氨醇单胞菌属、unidentified_Acidobacteria、溶杆菌属、芽孢杆菌属、Gaiella、单胞菌属、unidentified_Gammaproteobacteria等相对丰度有所减少，脱硫微菌属、Dongia等有所提高。在相对丰度排列前30且<1%的菌属分别是斯科曼氏球菌属(Skermanella)、脱硫叶菌属(Desulfobulbus)、Haliangium、芽孢菌属(Blastococcus)、节细菌属(Arthrobacter)、Acidibacter、Candidatus_Alysiosphaera、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、索利鲁布罗菌属(Solirubrobacter)、交替赤杆菌属(Altererythrobacter)、Iamia、壤霉菌属(Agromyces)、链球菌属(Streptococcus)、气微菌属(Aeromicrobium)、Steroidobacter、微小杆菌属(Microvirga)、链霉菌属(Streptomyces)、Stenotrophobacter、水沉积物杆菌属(Ilumatobacter)、罗氏菌属(Rothia)、马赛菌属(Massilia)。与对照相比，斯科曼氏球菌属(Skermanella)、芽孢菌属、节细菌属、Candidatus_Alysiosphaera、类诺卡氏菌属、索利鲁布罗菌属、交替赤杆菌属、壤霉菌属、微小杆菌属、Stenotrophobacter、水沉积物杆菌属、马赛菌属等有所减少。脱硫叶菌属、Haliangium、Acidibacter、Iamia、链球菌属、气微菌属、Steroidobacter、链霉菌属、罗氏菌属等有所增加。

图8 Cd胁迫对小麦根际土壤细菌门水平(A)和属水平(B)的影响

如图9所示，在相对丰度排列前30的菌属中，显著差异的分别是脱硫微菌属、Stenotrophobacter、Acidibacter以及链球菌属。脱硫微菌属、Acidibacter、链球菌属等较CK显著增加(P<0.05),而Stenotrophobacter等较CK显著降低(P<0.05)，这表明外源Cd的胁迫影响了小麦土壤根际细菌群落。

图9 Cd胁迫对小麦根际土壤典型菌属相对丰度的影响

3 结论与讨论

通过对Cd胁迫下小麦对Cd的吸收和积累的研究发现，Cd胁迫会降低小麦的生物量。聂胜委等[15]在研究重金属胁迫对小麦生长的影响及阈值的过程中发现，当Cd胁迫超过1.3和1.8 mg·kg-1时，则会抑制郑麦9023和小偃22的小麦生物量。本研究结果显示，Cd含量在2.0 mg·kg-1时造成小麦生物量的减少，推测是因为Cd胁迫使根系细胞分裂紊乱，细胞结构遭到破坏，进而影响到小麦的正常生长[16]。本研究发现，添加外源Cd可以促进小麦对Cd的吸收和积累，推测是由于在Cd胁迫下，小麦的根际微生物分泌大量有机酸，溶解难溶性Cd，并与Cd结合形成易于小麦吸收的形态，这与张丙春等[17]研究结果相似。此外，本研究还发现CK和T处理中地下部较地上部积累的Cd含量更高，推测是由于根部皮层细胞吸收的Cd与根内多糖、蛋白质、核酸等物质形成络合物或有机大分子沉淀物，使其不易向上运输[18]。与CK相比，T处理中小麦地上部和地下部BCF都有所降低而TF有所升高，表明在外源Cd的添加下会降低小麦各部位对Cd富集的能力，但会提高Cd从地下部向地上部的转运能力，这与孙聪等[19]研究结果相似。本研究还发现，外源Cd的添加明显使得小麦根际土壤有效Cd的含量增加，且使土壤pH值有下降的趋势，推测是因为Cd胁迫下小麦根际微生物分泌大量有机酸使土壤pH值下降，进而使土壤有效Cd含量显著增大。土壤有效Cd含量的增加和pH值降低可能是造成小麦Cd积累的重要原因。范洪黎等[20]研究表明，Cd胁迫诱导2个品种苋菜根系分泌的各种有机酸数量随供Cd量的增加而增加。王玉云等[21]在研究中发现，在一定阈值内水稻根系有机酸的分泌量与Cd积累量呈正相关。另外，HOU等[10]在研究Cd胁迫下不同水稻品种根际细菌群落特异性反应中发现高积累品种根际硫杆菌属(Thiobacillus)丰度增加，且其具有活化Cd和产酸能力。

微生物的生长易受外界环境干扰，不适应的微生物数量下降,适应生长的微生物数量增大并积累，从而使微生物多样性和群落结构发生变化[22]。本研究发现，Cd胁迫下增加了小麦根际土壤的细菌多样性并明显改变了细菌群落结构。一方面是在Cd胁迫下，小麦通过根系分泌有机酸等物质来提高土壤中Cd的有效性，而有机酸对根际土壤微生物的多样性和丰富度有显著影响，能够改变菌群的种类和数量。另一方面，Cd有效性的提高也会使耐受性低的微生物数量下降，同时土壤中有效态Cd含量增大改变了小麦土壤酶活和小麦根际代谢产物。BAATH等[23]研究发现，少量的Cd和Zn可以促进土壤呼吸，推测是土壤微生物在重金属胁迫下做出的应激反应。在属水平相对丰度前30的菌属中，链球菌属、Acidibacter、脱硫微菌属等在T处理中相对丰度较CK显著增大。Stenotrophobacter等在CK中相对丰度较T处理显著增大，且鞘氨醇单胞菌属等在CK中相对丰度较T处理也有所增加。链球菌可以利用根系分泌的简单糖类进行产酸[24]，推测这是造成Cd胁迫小麦根际土壤pH值下降，并造成有效Cd含量增大的重要原因。Acidibacter是可以分解蛋白和摄取周围环境酸性物质的菌属[25]。丁翠等[26]在研究中发现，在重度酸性矿山废水污染下可以显著改变土壤pH,且可以极大地丰富Acidibacter。因此，本研究推测小麦根际土壤有效Cd含量的增大和酸化是使Acidibacter含量增大的重要原因。另外，脱硫微菌属在T处理中的丰度显著大于CK。脱硫微菌是硫酸盐还原菌，具有还原硫酸根为硫离子进而钝化Cd的功能，而本研究中该菌在Cd胁迫下大量增殖，其机理尚需进一步探讨。鞘氨醇单胞菌可以在植物根际分泌糖类和吲哚乙酸等生长激素，促进植物吸收和生长[27-28]。本研究中，鞘氨醇单胞菌在CK中的相对丰度有所提高，可能是造成CK较Cd胁迫下生物量增加的重要原因。Stenotrophobacter是革兰氏阴性菌，目前鲜有对此菌功能的研究。综上所述，在外源Cd胁迫下小麦根际土壤微生物丰度和多样性均有所上升，细菌群落结构的变化与小麦根际土壤pH值和有效Cd含量有关。