siRNA沉默环指蛋白8基因对裸鼠人鼻咽癌移植瘤放疗增敏作用的实验研究

王茂鑫，陈贤明，龚宏勋，陈十燕，杨 帆，陈 函

0 引 言

鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，我国东南地区多发，近年来有增多趋势。放疗是鼻咽癌的首选治疗方法，但是鼻咽癌的放疗抵抗和复发仍是鼻咽癌治疗中的难点[1-3]。我们的前期工作已发现，抑制鼻咽癌细胞中环指蛋白8(ring finger protein 8, RNF8)的表达能够提高肿瘤细胞对放射线的敏感性[4]。但有关干扰RNF8基因表达在体内是否会提高鼻咽癌的放疗敏感性，目前还未见报道。本实验采用小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)沉默CNE1细胞的RNF8基因,筛选出稳定转染的细胞,注入裸鼠体内，建立移植瘤模型，探讨RNF8与鼻咽癌放疗抵抗的关系及沉默RNF8与鼻咽癌放疗敏感性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和主要试剂鼻咽癌CNE-1细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。RNF8沉默的CNE-1稳定转染细胞来自原福州总医院[1]。RNF8抗体(美国Santa Cruz公司)，共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutate,ATM)抗体(美国Biovision公司)，DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)抗体(美国Thermo公司)，异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate， FITC)标记的兔抗鼠二抗(美国Sigma公司)。AnnexinV-FITC (Abcam, Cambridge, UK)。

1.1.2 动物BALB/c裸鼠30只购自军事医学科学院实验动物中心(实验动物许可证号：2019-0496)；本实验经联勤保障部队第九○○医院伦理委员会批准(批准号：2016-021)。鼠龄3～4周龄，体重12～18 g，均为雄性，在无特定病原体(SPF)、恒定温度(22～25 ℃)的无菌层流动物房内饲养，经高压灭菌饲料和水供动物自由食用。

1.1.3 主要仪器荧光倒置显微镜(德国Leica公司)，BCM-1000A型生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson FAC Sort公司)，2100C型直线加速器(美国Varian公司)。

1.2 方法先用Westernblot法检测沉默和未沉默RNF8的细胞中RNF8的蛋白表达，用Image J软件分析条带灰度值，计算与内参GAPDH灰度值的比值，验证siRNA对RNF8的沉默效果。

1.2.1 裸鼠成瘤取沉默和未沉默RNF8的CNE-1细胞进行实验，CNE-1细胞制成单细胞悬液(台盼蓝拒染法计数活细胞数占95%以上)，用RPMI-1640培养液调细胞悬液为2×106个/0.2 mL，于每只裸鼠背部皮下接种细胞悬液0.2 mL，2周后待肿瘤直径达8～10 mm时进行实验。

1.2.2 成瘤裸鼠放疗将成瘤裸鼠30只按随机数字法分为RNF8未沉默组(RNF8+组)和RNF8沉默组(RNF8-组)，每组按放疗照射剂量的不同又分5个亚组，每个亚组3只，分别给予0、4、8、12、16 Gy照射,其中0 Gy为对照亚组。采用局部分割照射，裸鼠均放入特制容器固定，放置于放疗机，照射肿瘤局部，以1 cm厚铅板防护动物其余部位，照射距离为100 cm，照射野为4 cm×4 cm，剂量率为78 cGy/min。每次2 Gy。照射完成10 d后杀鼠取瘤，称重观察抑瘤情况,计算抑瘤率，公式为：

抑瘤率=[(对照亚组平均瘤重-每个剂量亚组平均瘤重)/对照亚组平均瘤重]×100%

1.2.3 将放疗后的肿瘤制成单细胞悬液取2组8 Gy剂量亚组肿瘤组织各约100 mg，在120目的不锈钢网下方置一平皿，用眼科小剪刀将肿瘤组织剪碎，再用镊子轻轻在网上搓组织块，边搓边用等渗盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的细胞混悬液用300目铜网过滤，收集细胞悬液，以800 r/min离心沉淀2 min(离心半径15 cm)。调整细胞数至1×106/mL，取0.1mL细胞悬液，用专用磷酸盐缓冲液[0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)+0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)]+2 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)洗涤，重悬。

1.2.4 Annexin V/propidium iodide (PI)双染检测RNF8+组8 Gy剂量亚组和RNF8-组8 Gy剂量亚组及其对照亚组凋亡率取100 μL细胞悬液加入10 μL AnnexinV-FITC, 轻轻摇晃，冰上避光孵育15 min，再加入 10 μL PI冰上避光孵育5 min，然后加入400 μL专用缓冲液制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。空白对照不加Annexin V-FITC+PI。

1.2.5 应用流式细胞仪检测DNA-PK、ATM的表达100 μL的RNF8+组8 Gy剂量亚组和RNF8-组8 Gy剂量亚组细胞悬液加入FC受体10 μL孵育，加入抗体(50 μg/mL)10 μL，4 ℃避光孵育1 h，0.01%PBS洗涤，离心，再加入FITC标记二抗，4 ℃避光孵育30 min，1%多聚甲醛固定，500目滤网过滤，重悬，空白对照不加一抗，流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1 RNF8沉默效果的验证结果RNF8在RNF8-组中只有微量表达(0.11±0.03)，而在RNF8+组中表达明显升高(1.18±0.23)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图示RNF8+组的RNF8表达明显高于RNF8-组

2.2 放疗后2组细胞在各个剂量点抑瘤率的比较随着放疗剂量的增高，2组的肿瘤均有所缩小，见图2。RNF8+组抑瘤率在各个剂量点均低于RNF8-组，其中，在8 Gy和12 Gy剂量点差异有统计学意义(P<0.05),但其中RNF8+组8 Gy剂量亚组和RNF8-组8 Gy剂量亚组差异最大(P<0.01)，见表1。

图示RNF8+组形成的肿瘤在各个剂量放疗后均大于RNF8-组

表1 RNF8未沉默与沉默成瘤裸鼠在各个放疗剂量点的抑瘤率比较

2.3 放疗后2组细胞的8 Gy剂量亚组凋亡率的比较放疗后RNF8+组8 Gy剂量亚组和 RNF8-组8 Gy剂量亚组凋亡率均较各自的对照亚组升高，且RNF8+组8 Gy剂量亚组凋亡率明显低于RNF8-组8 Gy剂量亚组(P<0.05)。见图3。

a:RNF8+组;b:RNF8-组

2.4 放疗后2组细胞的8 Gy剂量亚组的ATM和DNA-PKcs表达水平的比较放疗后RNF8+组8 Gy剂量亚组ATM的表达明显高于RNF8-组8 Gy剂量亚组，差异具有统计学意义(P<0.01)；RNF8+组8 Gy剂量亚组DNA-PKcs的表达亦高于RNF8-组8 Gy剂量亚组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 8 Gy放疗后RNF8未沉默与沉默裸鼠移植瘤的ATM、DNA-PKcs的表达比较

3 讨 论

鼻咽癌的放疗后残留和复发与多种因素有关，如肿瘤的分期、大小、侵犯范围、病理类型有关，但鼻咽癌细胞对放射线的抵抗亦是重要因素。而这种抵抗是通过对损伤的肿瘤细胞DNA进行修复实现的。放射线导致细胞DNA损伤，此时肿瘤细胞可以激活多种蛋白来修复损伤的DNA，从而使肿瘤细胞存活下来，放疗停止后，肿瘤细胞可以再次增殖导致复发。研究表明，细胞主要通过非同源性末端连接(DNA nonhomologous end-joining，NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)两种途径来修复损伤的DNA，DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)是前者关键酶，ATM是后者关键酶[5-8]。而RNF8是一个包含环指结构的E3泛素连接酶家族成员，在细胞受到电离辐射时，RNF8泛素化多种底物并募集多种因子至DNA损伤部位，进行DNA的修复[9-13]。Lu等[14]发现RNF8泛素化多种蛋白使Nijmegen断裂综合征1(Nijmegen breakage syndrome, Nbs1)等分子聚集在DNA损伤位点, 通过HR途径修复DNA。Wu等[15]发现RNF8与FHA和环指检查点(checkpoint with FHA and ring finger,Chfr)共同调控ATM的活性，进而调节ATM依赖的DNA损伤应答。我们前期从细胞和分子水平的研究表明，RNF8-的鼻咽癌细胞比RNF8+细胞对放射线更加敏感，凋亡率更高，即RNF8+细胞的抵抗力更强，表明RNF8参与DNA的损伤修复。而放疗后RNF8+细胞ATM的表达较RNF8-细胞高，表明RNF8激活ATM为主的HR途径，导致放疗抵抗[4]。本研究还从人鼻咽癌标本中检测RNF8的表达，发现RNF8阳性者残留和复发的发生率升高，生存率降低，提示RNF8参与鼻咽癌放疗抵抗[16]。

我们在活体内试验结果也得出类似结论。本研究通过对裸鼠移植瘤的研究发现，RNF8-组肿瘤较RNF8+组放疗后的生长抑制率高，提示RNF8-组更容易受到放射线损伤，而RNF8+组有放疗抵抗，由此可以推论RNF8参与DNA的损伤修复。在检测凋亡率的实验中，RNF8沉默后，放疗后肿瘤细胞凋亡率较RNF8+组明显升高，进一步证实了这一点,即缺少了RNF8, 肿瘤细胞更容易被放射线杀伤，表明RNF8在肿瘤细胞的放疗抵抗中具有重要作用。进一步的研究显示，RNF8+组放疗后ATM表达升高，而RNF8-组放疗后的ATM表达无明显变化，即肿瘤的RNF8表达受抑制后，接受射线照射其ATM表达也受抑制，表明ATM的表达是受RNF8调节或控制的，提示RNF8通过调节ATM，通过HR途径修复损伤的DNA。而DNA-PKcs在放疗后的RNF8-组和RNF8+组均有所升高，提示DNA-PK可能也参与了DNA的修复，但组间无明显差异，表明DNA-PK并不受RNF8的调节，与我们之前的研究结果有较好的一致性[4]。

总之，RNF8通过激活以ATM为主的HR途径来修复肿瘤细胞DNA，从而导致肿瘤的放疗抵抗。但鼻咽癌的放疗抵抗机制非常复杂，RNF8激活HR途径修复损伤的DNA只是其中的一个方面，这就需要更加深入地研究鼻咽癌的放疗抵抗机制，从而采取针对性的措施，减少放疗抵抗，提高肿瘤的放疗敏感性，进而提高患者生存率。