静松灵对小型猪不同脑区氨基酸类神经递质的影响

马相影 ， 李晓蕾 ， 申美伦 ， 张志恒 ， 李柔茜 ， 金箫迪 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

静松灵(盐酸赛拉唑或者盐酸二甲苯胺噻唑)，是一种α2-肾上腺素受体激动剂，于1974年在中国农业科学院兰州兽医研究所研制合成。静松灵具有良好的镇静、镇痛和肌肉松弛作用[1]。静松灵与隆朋化学结构相似，其药理作用更强，毒性更低，目前在我国兽医临床上被广泛应用[2]。麻醉药可改变氨基酸神经递质含量，从而改变相应受体功能发挥麻醉机制。氨基酸类神经递质在中枢神经系统中是重要的神经递质[3]，在学习、记忆等方面发挥作用[4]。目前氨基酸神经递质分为两类：一类是兴奋性神经递质，包括谷氨酸(GLU)和天冬氨酸(ASP) ； 另一类是抑制性神经递质，包括甘氨酸(GLY)和γ-氨基丁酸(GABA)[5]。本试验将小型猪注射静松灵后，观察各脑区氨基酸类神经递质含量的变化，探讨静松灵对不同脑区的作用部位以及在中枢神经系统中麻醉作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料 静松灵，由东北农业大学动物医学学院临床外科教研室提供；谷氨酸(GLU)标准品、甘氨酸(GLY)标准品、天冬氨酸(ASP)标准品、γ-氨基丁酸(GABA)标准品，批号分别为BCBB5881、109K0107、129K0181、0001446172，均购自Sigma公司。色谱级乙腈，DIMA TECHNOLOGY INC；色谱级甲醇，DIMA TECHNOLOGY INC；Waters 600 高效液相色谱仪；美国色谱柱，Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)Column。

1.2 试验分组 20头小型猪，3月龄，体重10～15 kg，临床检测健康状态良好。将20头小型猪随机分为4组，每组5头，分别为对照组、诱导组、麻醉组和恢复组。对照组肌内注射生理盐水[0.25 mL/(kg·bw)]，其他组肌肉注射静松灵[0.25 mL/(kg·bw)]。

1.3 样品采集与处理 根据试验观察，当小型猪注射静松灵后，小型猪卧地不起定义为诱导期，翻正反射消失定义为麻醉期，意识逐渐清醒定义为恢复期。对照组注射生理盐水后，将小型猪处死，立即取脑组织。其他组注射静松灵后观察小型猪行为，分别在诱导期、麻醉期、恢复期处死小型猪，立即取脑组织。取下的脑组织用预冷的生理盐水冲洗血迹，并在冰面上迅速分离脑组织，称重后放入冻存管中，用液氮冻存等待检测。

1.4 反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测氨基酸神经递质方法的建立 脑组织加研磨液研磨，离心后取上清液。将脑组织衍生。衍生条件：400 μL上清液，100 μL乙腈，400 μL NaHCO3溶液，200 μL 2，4-二 硝基氟苯，混匀，置于65 ℃恒温水浴锅55 min。流动相分A和B，A为醋酸钠缓冲溶液(pH=6.5)，B为乙腈/水(比例为50∶50)，进行梯度洗脱，流动相B的浓度由开始时65%经10 min至10%，18 min时至40%；流速：0.6 mL/min；检测波长设置360 nm；柱温设置28 ℃。脑组织通过RP-HPLC法处理后，取20 μL进样量，采用外标法定量分析，检测氨基酸神经递质的浓度。

1.5 数据处理 采用SPSS 19数据分析系统分析本试验的数据结果，数据用平均值±标准差表示。P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 静松灵麻醉后小型猪不同脑区神经递质GLU的含量 如图1所示，当小型猪注射静松灵后，不同的脑区内GLU含量在对照组的含量最高。大脑、海马、丘脑和脑干内GLU含量在诱导期、麻醉期和恢复期呈现逐渐下降趋势，与对照组相比均差异极显著(P<0.01)。小脑内GLU含量在麻醉期下降至最低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，在恢复期上升，但含量低于正常水平(P<0.01)。

图1 静松灵麻醉下小型猪不同脑区GLU的含量变化Fig.1 Effects of xylazole on the GLU in different encephalic regions of pigs注：与对照组比较, *:P<0.05, **:P<0.01;下图同Note：Compare to control group, * : P<0.05, **: P<0.01. The same as below

2.2 静松灵麻醉后小型猪不同脑区神经递质ASP的含量 如图2所示，当小型猪注射静松灵后，不同的脑区内ASP含量出现了不同的变化趋势。海马、丘脑和脑干内ASP含量出现相似的变化趋势，表现先下降再上升的趋势，在诱导期下降到最低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，麻醉期和恢复期逐渐上升。大脑出现了相反的趋势，在诱导期上升不显著，在麻醉期和恢复期下降，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。小脑中ASP含量在麻醉期下降到最低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，在恢复期逐渐恢复,但仍低于麻醉前水平(P<0.01)。

图2 静松灵麻醉下小型猪不同脑区ASP的含量变化Fig.2 Effects of xylazole on the ASP in different encephalic regions of pigs

2.3 静松灵麻醉后小型猪不同脑区神经递质GLY的含量 如图3所示，当小型猪注射静松灵后，不同的脑区内GLY含量出现了不同的变化趋势。大脑和丘脑内GLY含量表现先上升再下降的趋势，在诱导期上升到最高，与对照组相比，大脑差异极显著(P<0.01)，丘脑差异显著(P<0.05)，麻醉期和恢复期逐渐下降。海马、小脑和脑干内GLY的含量先下降再上升，海马和小脑在诱导期下降到最低，与对照组相比差异显著(P<0.05)，脑干在麻醉期下降到最低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

图3 静松灵麻醉下小型猪不同脑区GLY的含量变化Fig.3 Effects of xylazole on the GLY in different encephalic regions of pigs

2.4 静松灵麻醉后小型猪不同脑区神经递质GABA的含量 如图4所示，当小型猪注射静松灵后，不同的脑区内GABA含量出现了不同的变化趋势。大脑和丘脑内的GABA的含量表现先上升再下降的趋势，在诱导期上升到最高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，麻醉期和恢复期逐渐下降。海马和小脑内GABA的含量先下降再上升，海马在麻醉期下降到最低，而小脑在诱导期下降到最低，与对照组相比均差异极显著(P<0.01)。脑干各脑区GABA的含量变化，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

图4 静松灵麻醉下小型猪不同脑区GABA的含量变化Fig.4 Effects of xylazole on the GABA in different encephalic regions of pigs

3 讨论

静松灵作为一种麻醉药，通常会改变脑内神经元的活性，导致氨基酸神经递质的含量改变，从而改变相应受体的功能来发挥麻醉的机制。谷氨酸(GLU)和天冬氨酸(ASP)是中枢神经递质中最主要的兴奋性氨基酸神经递质[6]。当麻醉药作用在机体上，突触前的神经元会产生动作电位，Ca2+内流过多，氨基酸类神经递质胞外释放，作用在突触后膜的特异性受体上，产生兴奋性突触后电位，使脑内中枢神经元产生强烈的兴奋作用[7]。抑制性氨基酸类神经递质的中枢作用机制与兴奋性氨基酸传导过程相似，当抑制性氨基酸神经递质甘氨酸(GLY)和γ-氨基丁酸(GABA)释放时，突触后膜对K+和Cl-的通透性增加，引起Cl-内流为主，导致突触后膜超极化，从而产生抑制性突触后电位，使脑内中枢神经元产生抑制作用。目前有关静松灵复合麻醉剂对中枢系统氨基酸神经递质的研究比较多，而静松灵对中枢神经系统麻醉机制的研究比较少。因此，本试验通过静松灵对不同脑区4种氨基酸神经递质的含量的研究，探究静松灵对中枢神经系统可能的麻醉机制。

谷氨酸(GLU)不仅作用在神经细胞上，也作用在离子受体NMDA受体[8]。NMDA受体与镇痛、麻醉等方面有关。GLU除了在蛋白质结构中发挥作用外，在营养、代谢和信号传导中也起着关键作用。天冬氨酸(ASP)被归类为兴奋性氨基酸神经递质，也发挥同样的作用，但效果不如GLU强[9]。尹柏双等[10]研究认为，盐酸赛拉嗪的中枢麻醉作用可能与不同的脑区GLU和ASP含量的变化有关。甘氨酸(GLY)是人类大脑皮层里抑制性氨基酸神经递质，在哺乳动物的脊髓、脑干及视网膜含量很高。当动物注射静松灵后，GLY受体被激活，胞内Cl-浓度升高，导致抑制性突触后电位。γ-氨基丁酸(GABA)是谷氨酸的产物，也是主要的抑制性氨基酸神经递质之一。在生理作用下，GABA与特异性的受体结合，会改变突触后膜的Cl-和K+通透性，引起Cl-内流或K+外流，使突触后膜去极化，从而产生抑制性突触后电位。有研究表明，挥发性麻醉药主要通过增加GABA介导的突触抑制作用来抑制大脑皮层神经元的兴奋性[11]。

综上，小型猪注射静松灵后，小型猪小脑内兴奋性神经递质GLU和ASP在麻醉期含量下降,兴奋性电位减弱。大脑和丘脑抑制性神经递质GLY和GABA含量上升，抑制性电位增强。因此可以推测，静松灵在中枢神经系统中作用的部位主要是小脑、大脑和丘脑。静松灵的麻醉机制可能与抑制兴奋性神经递质释放和促进抑制性神经递质释放相关。