骨质疏松相关骨免疫学进展

张慎启 石磊 李文金，4 刘军川 薛庆云

(1北京医院骨科 国家老年医学中心 中国医学科学院老年医学研究院，北京 100730；2中国医学科学院 北京协和医学院研究生院；3山东枣庄市立医院关节与运动医学科;4北京大学医学部)

骨质疏松严重影响着国民生活质量，加重国家医疗负担。近年来在内分泌学机制的基础上，有学者提出“骨免疫学”概念。骨代谢的关键分子途径：核因子(NF)-κ B受体活化因子配体(RANKL)/NF-κ B受体激活蛋白(RANK)/骨保护素(OPG)的发现，使免疫与骨之间的关系得以证实。RANKL(tnfsf11)和RANK(tnfrsf11a)是一对受体/配体，成骨细胞释放的RANKL与破骨细胞表面的RANK结合后通过NF-κB途径、c-Jun氨基末端激酶(JNK)途径、蛋白激酶B(Akt)途径等促进破骨细胞的分化和激活。OPG由tnfrsf11b基因编码，可竞争性抑制RANK与RANKL的结合〔1〕。RANKL主要由骨基质细胞产生〔2〕，多为膜结合型，也可脱落形成可溶性蛋白〔3〕。RANK与RANKL主要在B细胞和活化的T淋巴细胞上表达。在体外， Janus激酶(JAK)1/2抑制剂可通过抑制成骨细胞中RANKL的表达来抑制破骨细胞的生成〔4〕。目前认为，一系列免疫因子和免疫细胞通过RANKL/RANK/OPG途径在调节骨细胞发育和骨转换中起着重要作用〔5〕。本文对近年来骨免疫学领域的新发现及观点进行综述。

1 骨代谢相关免疫细胞

1.1B淋巴细胞 B细胞能产生两种对骨代谢至关重要的细胞因子：RANKL及其生理抑制剂OPG〔6〕。RANKL促进破骨细胞分化、成熟和活化，并通过促进骨吸收导致骨质疏松〔7〕。而OPG是RANKL的可溶性受体，与RANKL结合从而阻断RANKL与RANK的结合，消除RANKL对破骨细胞的作用〔8〕。研究表明B细胞直接参与骨吸收的调节，并且是OPG的主要来源，约占总骨髓OPG产生量的60%以上。单纯就分泌OPG能力来讲，浆细胞大约是成熟B细胞的6倍，但考虑到浆细胞数量有限，目前普遍认为其占OPG分泌总量的1/5左右。小鼠实验中，B细胞发育缺陷的小鼠可因缺乏破骨细胞而引起骨硬化〔9〕。而Li等〔10〕发现B细胞敲除小鼠表现为骨质疏松表型，这是破骨细胞骨吸收增强的结果。检测其骨髓中的RANKL/OPG比率，发现OPG的mRNA和蛋白质表达存在特异性缺陷，另外由HIV诱导的B细胞功能障碍也导致了明显的骨丢失〔11〕。目前认为，B细胞表达OPG降低、RANKL增加，导致RANKL/OPG比例失衡，是HIV感染的动物模型和人类体内骨质流失的主要原因〔12〕。有实验证实，静息的B细胞并不能产生大量的RANKL，但活化的B细胞是其重要的来源，特别是在炎症状态下〔13〕。OPG在衰老过程中增加，但不能完全抵消内源性RANKL的增加。成骨细胞和B细胞是生理性OPG的重要来源，但成骨细胞OPG的产生随着年龄的增长而下降，表明在衰老过程中OPG的升高可能是B细胞功能变化的结果。有实验证实〔14〕，B细胞可导致衰老过程中OPG的浓度升高，以抵消年龄相关的过度骨吸收，随着年龄的增长，B细胞的丢失可能进一步导致OPG相对于RANKL的失衡，后者可导致年龄相关的骨丢失。B细胞对骨的影响由骨代谢的几种关键细胞因子调节因子介导，包括炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ，它们与绝经后骨质疏松的骨丢失密切相关〔15，16〕。另有报道称，B细胞上也可表达RANKL的受体：RANK〔17〕。同时，B细胞表达的RANKL可反过来促进B细胞的增殖。RANKL缺陷小鼠的B细胞发育受损，也提示其调节了B细胞的发育〔18〕。RANKL和OPG在骨和免疫系统中都发挥着重要作用，说明骨骼和免疫的交叉点〔6〕。

1.2T淋巴细胞 T淋巴细胞对成骨细胞和破骨细胞的刺激或抑制作用与T细胞亚群、细胞因子密切相关。T细胞可调节破骨细胞生成RANKL，在类风湿关节炎(RA)等自身免疫性疾病中，活化的T细胞通过表达RANKL直接诱导破骨细胞形成导致骨破坏，同时产生多种促炎性细胞因子，促进成骨细胞和骨髓基质细胞RANKL的表达间接诱导破骨细胞生成引起骨丢失〔19〕。如辅助性T细胞(Th)17既可通过分泌白细胞介素(IL)-17诱导成骨细胞上RANKL表达促进破骨细胞生成，又可刺激免疫细胞产生IL-1、IL-6等多种炎性细胞因子激活RANK信号来促进破骨细胞生成〔20〕。Th17细胞还可诱导成骨细胞和基质细胞中巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL的表达，产生RANKL和TNF-α，同时增加破骨细胞前体中的RANK表达，这些特征使它成为有效的破骨细胞生成诱导剂。相对于Th17细胞，调节性T(Treg)细胞虽被证明能抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，其作用机制目前尚不明确，目前多倾向于通过可溶性因子介导机制和接触介导机制发挥作用〔21〕，但Treg细胞在破骨细胞生成和骨吸收的调节中起着关键作用，Treg细胞水平的增加可能起到防御骨质疏松的作用。并且Treg细胞和Th17细胞之间的平衡可能在调节骨质破坏中起关键作用〔22〕。Choi等〔23〕将破骨细胞前体与活化淋巴细胞(B，CD4+T，CD8+T)在单独存在M-CSF或M-CSF+可溶性受体活化因子NF-kappab配体(sRANKL)的情况下共培养后发现，活化的B和CD4+T细胞，在单独存在M-CSF的情况下诱导破骨细胞分化；在M-CSF和sRANKL共存时，B细胞诱导高度活跃的破骨细胞形成，并增加了再吸收，而CD8+T细胞则明显地抑制了破骨细胞的生成。活化的B细胞表达许多破骨因子，包括RANKL、TNFα、IL-6、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α和单核细胞趋化蛋白(MCP)-3。CD8+T细胞表达大量的OPG和RANKL。而阻断OPG抗体并不能逆转CD8+T细胞的抑制作用，表明与其他因子有关。活化的B细胞促进破骨细胞生成，而CD8+T细胞则可抑制破骨细胞的形成。T细胞也可通过细胞表面受体如CD40L来调节成骨细胞〔24〕，T细胞-B细胞活性化分子(CD40L)属TNF-α家族成员，CD40L-CD40的相互作用对T细胞参与骨代谢作用至关重要〔25〕。研究发现，CD40L-CD40相互作用也可刺激OPG的产生〔26〕。雌激素缺乏增加了表达CD40L的T细胞的数量，这些T细胞通过基质细胞促进M-CSF和RANKL的表达，并下调OPG的产生〔27〕，或可能通过改变RANK/RANKL/OPG通路而发展为绝经后骨质疏松，而导致绝经后骨质流失的细胞因子(如TNF-α、IL-1)也是T细胞产物〔28〕。也有研究发现，绝经后妇女幼稚T细胞水平降低，记忆T细胞水平增加〔29〕。同时，骨质疏松患者的CD3+CD28+T细胞水平较低。因此，有学者怀疑CD28+的缺失可能与骨质疏松发生过程有关〔30〕。RANKL对破骨细胞的形成是必不可少的〔31，32〕，而表达于T细胞表面的RNAKL，也可介导T细胞的分化、调节Treg细胞稳态并参与免疫耐受的建立，动物实验发现，缺乏RANKL的小鼠表现出淋巴结器官发育缺陷〔33〕。

2 骨代谢相关细胞因子

2.1TNF-α 在骨质疏松时骨髓T细胞由CD8+淋巴细胞激活，并分泌相对高水平的效应细胞因子，主要是TNF-α。它可促进破骨细胞前体形成，并通过其他炎症细胞，导致成骨细胞增殖受损。由TNF-α激活的内皮细胞通过细胞黏附分子的表达将循环中的破骨细胞前体细胞吸引到炎症部位，在RANKL刺激下成为活性破骨细胞〔34〕。骨质疏松是一个整合协同信号通路和细胞因子的系统模型，而TNF-α是骨吸收的有效触发器〔35〕。TNF-α的单克隆抗体(MAB)可有效预防或逆转全身性骨质疏松〔36〕。具体来说TNF-α可刺激破骨细胞的形成和活性、促进RANKL表达，从而影响骨吸收，此外，TNF-α上调了成骨细胞和基质细胞中CD40的形成，抑制了OPG的分泌〔35〕。研究证实，TNF-α还抑制成骨祖细胞的成熟和成骨细胞活性，成骨细胞活力随着TNF-α浓度的增加而降低，在同样浓度的TNF-α处理过的细胞中，细胞活力随着时间的推移而降低，而高浓度的RANKL和TNF-α进一步刺激破骨细胞生成导致骨吸收〔37〕。此外，实验证明TNF-α通过增加成骨细胞凋亡，抑制参与骨形成的基因，从而降低成骨细胞活性，凋亡是TNF-α诱导成骨细胞死亡的主要方式，并且在成骨细胞系中优先诱导凋亡，而当TNF-α的诱导作用被凋亡抑制剂抑制时，坏死作用起决定性作用。因为当Caspase-8抑制剂氟甲基酮(Z-IETD-FMK)阻断TNF-α诱导的细胞凋亡时，坏死仍然存在〔37〕。另外，脂肪组织，主要是内脏脂肪组织分泌的TNF-α也可通过调节RANKL/RANK/OPG信号通路来刺激破骨细胞活性〔38〕。同时TNF-α和IL-6也抑制脂联素和脂肪细胞的产生〔39〕，进一步抑制了成骨细胞增殖、成熟。这也解释了肥胖与骨密度负相关的原因。

2.2IL-11 IL-11功能活性包括识别同源受体和诱导糖蛋白(GP)130受体介导的细胞内信号传导〔40〕。健康人的体液中基本没有IL-11〔41〕，它可直接诱导破骨细胞分化〔42〕，有学者通过JAK1/信号传导与转录激活因子(STAT3)激活的c-myc基因途径发现IL-11可不通过RANKL来诱导破骨细胞生成，蛋白质印迹结果显示，IL-11诱导的破骨细胞生成需要JAK1/STAT3激活来进一步诱导c-myc的表达，而这是破骨细胞生成所必需的因素，但RANKL诱导的破骨细胞生成则不需要〔43〕。最近发现，IL-11的增强表达可能涉及磷脂肌醇信号途径(pkcδ)信号通路〔44〕。

2.3IL-17 IL-17由CD4+T细胞、执行固有免疫功能(γδ)T细胞、自然杀伤细胞、恒定自然杀伤T细胞、固有淋巴细胞和CD8+T细胞产生〔45，46〕。IL-17作用于滑膜细胞和成骨细胞，可导致滑膜炎和骨破坏〔47〕。在RA的发展过程中，MCS通过促进Th17细胞向炎症关节的迁移及IL-17生成的增加，促进Th17介导的慢性炎症而引起骨量流失〔35〕。IL-17能够刺激成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞产生IL-6、IL-8和前列腺素(PG)E2。PGE2能诱导基质金属蛋白酶(MMP)的合成，而MMP可引起破骨细胞性骨破坏。同时，IL-17也能诱导成骨细胞产生RANKL的受体激活剂〔48〕。

2.4IL-6 IL-6与IL-11具有相似的三级结构，都能通过激活JAK/STAT和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，促进炎症性骨微环境，参与骨吸收过程中破骨细胞的直接激活，导致骨破坏和骨质减少〔40，49〕。IL-6作用于祖细胞可促进破骨细胞生成，导致破骨细胞活性增加和骨溶解〔49〕。体外研究表明，IL-6转导信号还可通过增加成骨细胞和T细胞中RANKL的表达来促进破骨细胞的发生〔50〕，其中，RANKL的过度表达与IL-6含量正相关〔35〕。健康人的体液中基本没有IL-6〔51〕，而在RA患者中，IL-6是关节液中含量最丰富的细胞因子之一，RANKL在RA滑膜中高度表达，因此导致该类患者骨质疏松的发病率更高〔52〕。IL-6也被证明在分化后期抑制了成骨细胞前体细胞的增殖，同时诱导了成骨细胞凋亡而加剧骨溶解。IL-6可通过减少参与成骨细胞分化的基因表达来降低成骨细胞分化，也可降低成骨细胞矿化骨骼的能力〔53〕。过度表达IL-6的转基因小鼠显示，随着成骨细胞的减少和破骨细胞数量的增加，骨转换增加，导致骨质减少。PGE2由脂肪酸花生四烯酸通过环氧合酶(COX)-2代谢而产生。COX-2的过度表达是由IL-6信号驱动的，可导致PGE2的产生增加。在成骨细胞和单核或巨噬细胞系中使用抗IL-6抗体，可通过减少PGE2来增加了OPG的分泌，因此，PGE2增加了IL-6信号转导作用，通过抑制OPG促进破骨细胞生成〔49〕。认为IL-6对骨骼完全有害是过于简单的，其对骨骼的作用与其剂量有关，低水平的IL-6可促进骨溶解，而高水平的IL-6可促进骨桥蛋白的发展，从而具有抗骨吸收作用〔35〕。且有研究表明它在骨骼修复中起关键作用。过度表达IL-6的转基因小鼠表现出骨丢失增强、骨样骨化缺陷和成骨细胞活性降低，但其他研究也表明，IL-6敲除小鼠显示骨结构异常和骨折愈合延迟，这些IL-6敲除小鼠表现出延迟矿化和骨重塑，在愈合早期阶段胶原和软骨水平升高，破骨细胞数减少。表明在骨折修复中，IL-6诱导的骨丢失是必要的〔49〕。

2.5M-CSF M-CSF具有许多促炎功能，并在自身免疫和炎症疾病的发展中发挥重要作用。M-CSF能够启动单核细胞或巨噬细胞的活化和炎性细胞因子的产生，不仅能够影响髓系细胞的表型，而且能通过各种髓系中间物激活T细胞〔54～56〕。M-CSF通过激活中性粒细胞中的炎性体来诱导IL-1β表达而成为致病性淋巴细胞和中性粒细胞之间的通讯器〔57〕。与RANKL一样，M-CSF在破骨细胞生成的连续过程中是必不可少的，包括破骨细胞前体增殖、黏附、迁移和细胞-细胞融合形成多核细胞。M-CSF与其受体的结合导致MAPK和Akt级联的激活，从而使破骨细胞存活〔58〕。在破骨细胞分化和骨吸收过程中，M-CSF通过MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)、JNK和P38信号传导发挥作用。不同的是，M-CSF激活的MAPK信号主要参与破骨细胞前体增殖的调节，而RANKL诱导的MAPK激活主要与破骨细胞分化有关，M-CSF和RANKL在正常破骨细胞代谢中充当破骨细胞生成的关键调节因子，并共享ERK、JNK和P38作为信号介质。此外，M-CSF通过MAPKs的立即磷酸化(5～20 min)诱导单相活化；RANKL通过MAPKs的立即磷酸化(5～20 min)和延迟磷酸化(8～24 h)导致双相活化。RANKL诱导的延迟MAPK激活的时间与破骨细胞分化的开始时间一致。因此，M-CSF和RANKL诱导的差异MAPK信号分别决定破骨细胞前体增殖和破骨细胞分化。通过RANKL/RANK信号激活的JNK和P38分别主要介导破骨细胞凋亡和促进破骨细胞分化，而通过M-CSF/巨噬细胞集落刺激因子受体(c-fms)轴激活的ERK优先增强破骨细胞前体增殖〔59〕。M-CSF还可刺激αvβ3整合素在破骨细胞中表达，并与整合素αvβ3一起通过ERK1/2和c-fos信号通路调节破骨细胞分化〔58〕。双磷酸盐已被用于治疗骨质疏松，含氮的二磷酸盐就是通过抑制ERK1/2和Akt来减弱RANKL、M-CSF的诱导破骨细胞形成作用〔60〕。

2.6IFN-γ IFN-γ由多种淋巴细胞细胞产生，包括CD4+和CD8+T细胞、Treg细胞、Foxp3+CD8 T细胞、γδT细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞，它在免疫反应以及炎症调节中具有关键作用〔61〕。在骨骼中，IFN-γ同时影响成骨细胞和破骨细胞。IFN-γ增加了成骨细胞分化基因的表达，如Runt相关转录因子(Runx)2、成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素〔62〕。敲除IFN-γ受体的小鼠显示成骨细胞分化降低，用抗体阻断IFN-γ后，成骨活性增加。其中人骨髓间充质干细胞也产生IFN-γ来促进自身的成骨分化〔63〕。除了抑制破骨细胞分化外，IFN-γ还通过促进破骨细胞凋亡来减少破骨细胞的形成。IFN-γ可通过诱导骨髓细胞FasL表达来抑制TNF-α促破骨细胞作用。IFN-γ也可通过Fas-FasL相互作用直接促进破骨细胞前体凋亡。其中，促进破骨细胞凋亡可能是通过激活NF-κB通路来完成〔64〕。但IFN-γ抑制破骨细胞作用呈剂量或时间依赖性，低水平的IFN-γ对破骨细胞没有抑制作用，另外IFN-γ的抑制作用似乎仅限于破骨细胞分化的早期。IFN-γ在增殖分化早期下调c-fms和RANK抑制破骨细胞生成，而M-CSF/c-fms信号和RANK/RANKL通路对早期破骨细胞增殖和分化都具有重要意义。IFN-γ作用于RANK/RANKL通路的多个位点，包括RANK、traf6和nfatc1。在破骨细胞分化的早期，IFN-γ可增加traf6的降解或下调RANK/RANKL通路下游的nfatc1，从而抑制破骨细胞的生成。然而在破骨细胞形成后期，IFN-γ可上调nfatc1促进单核破骨细胞的融合。除了直接作用外，IFN-γ还通过激活T细胞间接增加破骨细胞因子，促进破骨细胞的形成〔61〕。长期低剂量使用IFN-γ可促进骨形成，抑制早期破骨细胞分化，而短期高剂量使用IFN-γ可在分化后期促进破骨细胞形成。同时，IFN-γ可激活免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应来促进破骨细胞生成〔61〕。另外，IFN-γ对脂肪生成有抑制作用，间接影响破骨细胞活性〔65〕。

综上，骨重建受成骨细胞/破骨细胞之间的平衡、骨/免疫系统的相互作用调控。RANKL/RANK/OPG信号通路可通过调控骨重建参与骨质疏松的发生、发展。骨形成和再吸收的各个阶段都受到免疫系统的严格控制。由于它们共享共同的信号通路和调节机制，所以其各种调节作用相关交织、紧密相连的。细胞因子、趋化因子等信使及其受体的复杂网络是骨免疫学的基础。因此，骨质疏松可被认为是一个综合信号通路和细胞因子协同工作的系统模型。免疫细胞可在许多方面影响骨骼的健康，骨细胞也可影响免疫系统，并利用多种免疫因子发挥其生理功能。RANKL/RANK相互作用还调节T细胞/树突状细胞联系、树突状细胞存活和淋巴结形成，体内骨细胞的消融可导致严重的淋巴减少，并可通过重建骨细胞群而恢复〔66〕。缺乏RANKL的小鼠不仅由于缺乏破骨细胞而导致骨硬化，而且还表现出免疫缺陷，淋巴细胞发育受损，淋巴结器官生成缺乏〔67〕。骨免疫学已经对骨骼/免疫系统病理生理学联系做出了重大贡献，即免疫系统在成骨细胞和破骨细胞之间引起失衡，这种相互作用的中心是促炎性和破骨细胞因子，它们驱动骨的再吸收，从而最终导致骨质疏松。因此，骨免疫学是研究骨质疏松的一种新方法。但免疫细胞及其因子的骨免疫调控作用相互交织、错综复杂，其机制有待于进一步研究。