基于PI3K/AKT/mTOR信号通路的制首乌大黄素有效成分抗ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化

张磊 田维毅 王和生 赖陈岑 李妹娟 夏丽 冷传龙

(1贵州中医药大学,贵州 贵阳 550002；2贵州中医药大学第一附属医院中心实验室)

心血管疾病的发生和死亡呈日益增长的趋势，作为其重要病理基础，动脉粥样硬化(AS)的预防与治疗已成为影响人类健康的重点研究对象。AS是脂质在动脉血管内膜大量积聚使外观呈现出黄色粥样硬化斑块，主要累及大、中动脉。病变过程中两个关键环节：脂质积聚和炎症反应，循环往复，相互影响〔1〕，使脂质不断浸润，内膜损伤加剧，最终纤维帽变薄、斑块破损、游离，变成血栓，它是基于脂质浸润和损伤反应理论基础上，进一步发展的慢性炎症疾病〔2〕。本实验希望通过研究制何首乌大黄素通过调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路及其通路相关因子磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)来明确其防治AS的发生发展机制，为中医药防治AS，开发有效、低毒副作用的抗AS药物提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1试验药物和动物 大黄素购自西安飞达生物有限公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；血脂康购自维信生物科技有限公司。6周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠12只，ApoE-/-小鼠72只，体重(20±2)g，均购自贵州医科大学，合格证号编号为SCXK(黔)2012-0001。

1.2试剂 抗mTOR抗体、抗AKT1/AKT2/AKT3抗体、anti-PI3K p85 α抗体、抗mTOR(phospho S2481)抗体均购自美国Abcam公司；RNA纯化试剂盒、蛋白Ladder均购自美国Thermo公司；高效RIPA组织细胞裂解液、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、RNAwait、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)胶促凝剂均购自北京索莱宝生物科技有限公司；免染胶试剂盒12%、7.5%，快转液购自美国BIO-RAD公司。

1.3仪器 高速冷冻离心机购自长沙迈佳森仪器设备有限公司；超低温冷冻冰箱购自青岛海尔特种电器有限公司；全自动酶标仪购自上海赛默飞仪器有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪；微电脑PCR仪；化学成像发光系统；蛋白转印槽购自美国BIO-RAD公司；电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.4方法

1.4.1造模与给药 将72只成年雄性ApoE-/-小鼠普食喂养1 w，然后随机分成6组：AS模型组、高、中、低剂量组、阳性对照组和大黄素中剂量+雷帕霉素组(联合给药组)，每组12只。正常对照组为成年健康雄性C57BL/6J小鼠12只。采用炎症反应诱导法合并高脂饲料法进行ApoE-/-小鼠AS造模，除正常对照组外，其他6组小鼠用高脂饲料(21%猪油、0.15%胆固醇、78.85%基础饲料)饲养，并每隔1 d腹部皮下注射脂多糖(LPS)25 μg/只，9 w后，随机取一造模小鼠和正常小鼠主动脉，进行油红O染色，显微镜下观察主动脉形态有AS斑块的形成证明造模成功后停止LPS给药；给药组小鼠基于高脂饮食，高、中、低剂量组小鼠分别按40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌服大黄素，阳性对照组血脂康200 mg/kg灌胃，大黄素中剂量+雷帕霉素组(联合给药组)给予20 mg/kg大黄素及腹部皮下注射雷帕霉素溶液1 mg/kg，所有药物体积0.5 ml，持续给药6 w后取材。

1.4.2生化检测 采用生化试剂盒，全自动酶标仪测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1.4.3组织HE染色 将主动脉血管组织脱水、浸蜡、包埋后切片，按照HE染色试剂盒说明进行透明、复水、染色、封片，在光学显微镜下观察病理组织切片并做图像采集保存。

1.4.4qRT-PCR检测mTOR、PI3K、AKT mRNA表达水平 提取小鼠心肌组织总RNA50 μl，以RNA为模板，按试剂盒说明进行反转录得cDNA，根据试剂盒说明书，于冰上配制各组反应液，进行qRT-PCR反应，PI3K：上游引物：5′-GCTCCTGGAAGCCATTGAGAA-3′,下游引物：5′-CGTCGATCATCTCCAAGTCCAC-3′；AKT：上游引物：5′-AGTCCCCACTCAACAACTTCT-3′，下游引物：5′-GAAGGTGCGCTCAATGACTG-3′；mTOR：上游引物：5′-AATACGCCATGAAACACTTCG-3′，下游引物：5′-GGTCTTCCTTGTTTGTGTCCA-3′；β-actin：上游引物：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。扩增程序：阶段1：预变性，50℃，120 s，循环1次；95℃，600 s，循环1次；阶段2：热循环，95℃，15 s，60℃，60 s，循环40次；阶段3：溶解曲线，65℃，5 s，95℃，5 s，循环1次。

1.4.5Western印迹检测心肌组织mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT蛋白表达水平 按BCA试剂盒说明书操作，根据标准曲线计算心肌蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后置于100℃水浴锅中孵育5 min，使蛋白质变性。取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电脉(PAGE)，转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶室温孵育150 min。TBST洗膜3次，每次10 min。洗膜完成后孵育对应一抗4℃过夜。第2天洗膜3次，再孵育二抗1 h。洗膜3次后显影，使用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值分析相对蛋白表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、非参数检验。

2 结 果

2.1各组血脂指标水平比较 与模型组比较，给药各组TC、TG、LDL-C水平均明显降低(均P<0.05)。除低剂量组外其余给药组HDL-C水平均明显高于模型组(均P<0.05)。提示从血脂水平变化上看，制首乌大黄素对脂质代谢起一定作用，促进血清中HDL-C的合成，加速TC、TG、LDL-C的分解，有降血脂的作用。见表1。

表1 各组血脂指标水平及心肌组织mTOR、PI3K、AKT mRNA比较

2.2HE染色观察小鼠胸主动脉病理改变 模型组内膜明显增厚，可见大的脂质核心，斑块纤维帽变薄并伴有破裂；高剂量组内膜稍有增厚；中剂量组内膜增厚，稍有破裂，但细胞排列整体有序；低剂量组内膜变薄，有脂质堆积，见玻璃样变形成；阳性对照组内膜增厚，斑块纤维帽较薄；联合用药组内膜稍增厚，未见脂质。提示高、中剂量组和联合用药组对AS斑块形成干预效果好，血管内没有脂质堆积，未见斑块形成，内膜未见脂质核心，而大黄素低剂量干预效果不佳。见图1。

图1 各组主动脉病理(HE，×400)

2.3各组mTOR、PI3K、AKT mRNA水平比较 与模型组比较，高、中剂量组、阳性对照组和联合用药组mTOR mRNA水平明显降低(P<0.05)；高、中、低剂量组和联合用药组PI3K mRNA水平明显降低(P<0.05)。高、中剂量组、联合用药组和阳性对照组AKT mRNA水平明显降低(均P<0.05)。见表1。提示制首乌大黄素对mTOR、PI3K、AKT mRNA起抑制影响，但低剂量无明显作用。

2.4各组心肌组织PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平比较 与模型组比较，高、中剂量组、联合用药组PI3K蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；高、中剂量组AKT蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。高、中、低剂量血、阳性对照组和联合用药组mTOR蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。高、中、低剂量组和联合用药组p-mTOR蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。提示一定剂量的制首乌大黄素对PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达有抑制作用。见表2、图2。

表2 各组心肌中PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平比较

1～6：模型组；高剂量组；中剂量组；低剂量组；阳性对照组；联合用药组图2 各组心肌组织PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平

3 讨 论

AS发病机制复杂，与炎症、免疫、氧化应激、脂质代谢等有关〔3〕。自噬发生在真核细胞内，是自身物质成分被溶酶体所降解的过程〔4〕。细胞自噬与脂代谢可以相互影响，细胞自噬降解脂质，还能调节胆固醇逆向转运〔5〕。AS的发病机制也与自噬有关，mTOR是影响巨噬细胞发生自噬的抑制因子，通过抑制其活化可刺激机体自噬的增加，p-mTOR作为mTOR磷酸化蛋白，是判断通路活化的判定标准。在AS病理发展过程中，mTOR信号通路被激活，促进细胞增殖、迁移，扩大炎症反应，诱导脂代谢紊乱，调控细胞免疫应答等〔6〕。有研究表明，在LPS诱导下，mTOR信号通路激活〔7〕。巨噬细胞通过自噬，调节胞内环境稳态，拮抗细胞凋亡，从而发挥稳定AS斑块的影响〔8〕。mTOR相关抑制剂是雷帕霉素〔9〕，可抑制平滑肌细胞增殖。

大黄素是制何首乌游离蒽醌的主要成分，可通过降脂、抗炎等达到抗AS的作用，且在相互作用中调节多条信号通路，如ABCA1、NF-κB、JAK/STAT3等信号通路〔10，11〕。其中，mTOR涉及细胞炎症与自噬的调控中枢，也受到了影响。本研究结果表明制何首乌大黄素对ApoE-/-小鼠AS模型中的病变有明显疗效，能够降低血清中TC、TG、LDL-C的含量，升高HDL-C的含量，起到调节血脂及保护血管的作用，且能够抑制mTOR信号通路及mTOR信号通路上游PI3K/AKT信号活性，刺激机体自噬增加，增加糖脂的代谢，从而达到抗AS的作用，为中药治疗AS提供了新视角。