优化盐酸浓度、水解时间和氢氧化钠量改善糖原含量鉴定效果*

黎威巍，李菁琦，李 彦，张 燕，金科华

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)

饥饿与饱食对肝糖原含量的影响是一个重要的综合性生化实验，该实验通过糖原水解产物与班氏试剂反应生成砖红色氧化亚铜的量来判断糖原含量的高低。笔者按本教研室实验教程[1]带教时，发现从饱食小鼠的肝脏提取的糖原水解产物与班氏试剂反应沉淀量太少或无沉淀。实验失败易导致学生丧失实验兴趣，降低教师带教的激情。为解决这一问题，我们对水解糖原的盐酸浓度、水解时间及氢氧化钠的量进行优化，显著改善了糖原鉴定效果，现予以报道。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

家兔由我校动物室提供。分析纯三氯乙酸、氢氧化钠为天津欧博凯化工有限公司产品，浓盐酸为国药集团化学试剂有限公司产品。分别将三氯乙酸、氢氧化钠溶于蒸馏水，配制5%三氯乙酸、20%氢氧化钠各200mL。B-广范试纸(pH1-14)为上海三爱思试剂有限公司产品。

1.2 糖原的提取

将家兔颈椎脱臼处死，取20g肝脏，分成10等分，剪碎，每份加6mL 5%三氯乙酸，制备匀浆。匀浆于3 600r/min室温离心4min(下同)。上清液转移至另一离心管中，加等体积无水乙醇，混匀，离心。弃上清，将离心管倒扣于纸巾上，吸干残存液体，50℃烘干，取风干的糖原400mg溶于10mL蒸馏水，配制40mg/mL糖原溶液。

1.3 盐酸浓度对糖原水解的影响

取5支1.5mL EP管，依次编号为1、2、3、4、5，按表1依次加入糖原溶液，蒸馏水和浓盐酸，涡旋混匀，置沸水浴反应5min，取出，置冰水中冷却2min。取糖原水解20 μL于反应板上，与等体积的 0.3%碘液混匀，比较红褐色深浅。见表1。

表1 盐酸浓度对糖原水解的影响

1.4 时间对糖原水解的影响

取8支1.5mL EP管，依次编号为1、2、3、4、5、6、7、8，按表2依次加入糖原溶液和浓盐酸，涡旋混匀，置沸水浴水解0～3.5min，取出，置冰水中冷却2min。取糖原水解10μL于反应板上，与等体积的0.3%碘液混匀，比较红褐色深浅。见表2。

表2 水解时间对糖原水解的影响

1.5 氢氧化钠浓度对班氏试剂反应的影响

将4mL糖原溶液与800μL浓盐酸涡旋混匀，按650μL/管分装至5支1.5mL EP管中，沸水浴反应3.5min，取出，置冰水中冷却2min。按表3加入氢氧化钠和蒸馏水，涡旋混匀。取中和后的水解液300μL分别与150μL班氏试剂涡旋混匀，置沸水浴中反应3min，取出，置冰水中冷却2min，记录沉淀量。见表3。

表3 氢氧化钠量对班氏试剂反应的影响

2 结 果

2.1 盐酸浓度对糖原水解的影响

盐酸浓度对糖原水解影响的结果见图1(封三)，由图可知，糖原水解速度随盐酸终浓度增大而加快。终浓度0.5mol/L的盐酸，即可有效水解糖原；盐酸终浓度达到2mol/L及以上时，5min内即可将反应体系中的糖原完全分解。

2.2 时间对糖原水解影响

终浓度2mol/L的盐酸反应时间对糖原水解影响的结果见图2(封三)。可知，随时间加长，糖原水解程度加深，至3.5min时，糖原完全水解。

2.3 氢氧化钠中和盐酸的最佳用量

不同体积的氢氧化钠中和水解产物中的盐酸后，中和液与班氏试剂反应的结果见图3(封三)。由图知，不加氢氧化钠(图3A)及加300μL氢氧化钠(图3B)中和的管均无沉淀生成；加380μL氢氧化钠中和的管开始出现砖红色沉淀(图3C)；加420μL氢氧化钠的管沉淀明显增多(图3D)；当氢氧化钠为460μL时，沉淀较之380μL未见增多(图3E)。综上可知，随中和盐酸所用氢氧化钠量的增加，水解产物与班氏试剂反应的沉淀从无到有，从少到多，当氢氧化钠为420μL时，沉淀量达最大值。

3 讨 论

沸水浴时，盐酸催化糖原水解为葡萄糖。诸多实验教程[2-4]都限定了水解糖原所用浓盐酸体积和反应时间，未探究盐酸终浓度对水解反应速度的影响，便用氢氧化钠中和盐酸，终止水解反应，取糖原水解液与班氏试剂反应。如此操作，若糖原水解不充分，生成的葡萄糖少，易导致水解产物与班氏试剂反应生产的氧化亚铜沉淀不明显。本研究发现，随盐酸浓度增加和水解时间延长，糖原水解程度增加。为此，笔者建议实验者在用氢氧化钠中和盐酸前，取少量水解液和水解前的糖原分别与碘液反应，判断糖原水解程度，确认水解完全，再用氢氧化钠终止水解反应。

弱碱性的班氏试剂与葡萄糖反应生成砖红色沉淀[5]。在酸性环境中，班氏试剂中的Cu2+较为稳定，不容易与葡萄糖发生反应。为此，中和糖原水解液中的盐酸，使水解液呈碱性是班氏试剂与葡萄糖反应的前提。中和水解液中的盐酸所用的氢氧化钠量与砖红色深浅的关系未见文献报道。实验教程中用6～8滴20%的氢氧化钠中和水解反应中的10滴浓盐酸，并强调滴加的氢氧化钠中和液以使石蕊试纸刚变蓝为宜。浓盐酸摩尔浓度为12mol/L，20%氢氧化钠摩尔浓度为5mol/L，理论上，中和本反应体系中浓盐酸的所需氢氧化钠体积为盐酸体积的2.4倍。可见，教程中中和盐酸所用的氢氧化钠量远远不够。340μL氢氧化钠中和水解液中的150盐酸后，中和液刚使pH试纸变蓝(少于此体积，试纸不变蓝)，但此时并没有沉淀生成。当氢氧化钠的增加至380μL时，中和液与班氏试剂反应才出现砖红色沉淀，随氢氧化钠体积增加，沉淀逐渐加深；当氢氧化钠达到420μL时，砖红色达到最深，继续增加氢氧化钠，砖红色不再加深。

班氏试剂通过其成分中的碳酸钠维持弱碱性环境。图3A和3B管中的水解液中的盐酸若未经氢氧化钠中和或氢氧化钠的量不够，加入班氏试剂即产生大量气泡，表明水解液中的盐酸分解碳酸钠，破坏弱碱性环境，导致无氧化亚铜沉淀生成。