脾气虚大鼠肝脏细胞线粒体蛋白质控的研究

王艺璇 刘文俊 许欣竹 马丽娜 陈文娜 宋囡 单德红

【摘要】 目的：觀察肝细胞线粒体结构和功能及其蛋白质控，探讨肝耐受脾气虚的可能机制。方法：16只SPF级雄性SD大鼠根据随机数字表法平均分成两组，即8只正常组（对照组）和8只脾气虚组（模型组）。透射电镜观察肝细胞线粒体结构，比色法和JC-1法分别检测肝组织ATP和肝细胞线粒体膜电位（membrane membrane potential， MMP），Western blot法检测肝细胞线粒体热休克蛋白（hot shock protein， HSP）70、Lon蛋白酶（Lon protease， LonP）以及酪蛋白裂解酶（caseinolytic protease， Clp）XP复合物等表达。结果：两组线粒体大量分布于细胞核附近，形态相似，均呈卵圆形，边缘清楚，内部致密，未见到明显异常变化。与正常组相比，模型组ATP和MMP水平均下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。与正常组相比，模型组HSP70、ClpX、ClpP表达均上升，LonP表达下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：肝耐受脾气虚的机制与肝细胞线粒体蛋白质控机制增强有关。

【关键词】 脾气虚 线粒体 HSP70蛋白 Lon蛋白酶 ClpXP复合物

Study on Mitochondrial Protein Control of Liver Cells in Spleen Qi Deficiency Rats/WANG Yixuan， LIU Wenjun， XU Xinzhu， MA Lina， CHEN Wenna， SONG Nan， SHAN Dehong. //Medical Innovation of China， 2021， 18（14）： 0-022

[Abstract] Objective： To observe the structure， function and protein control of hepatocyte mitochondria and explore the possible mechanism of liver tolerance to spleen qi deficiency. Method： A total of 16 SPF male SD rats were divided into two groups according to random number table method， namely 8 normal group （control group） and 8 spleen qi deficiency group （model group）. The mitochondrial structure of liver cells was observed by transmission electron microscopy. The ATP of liver tissue and the mitochondrial membrane potential （MMP） of liver cells were detected by colorimetric method and JC-1 method， respectively. Western blot was used to detect expressions of hot shock protein （HSP70）， Lon protease （LonP） and caseinolytic protease （Clp） XP complex. Result： A large number of mitochondria in the two groups were distributed near the nucleus， and the morphology was similar， with oval shape， clear edge and dense interior， and no obvious abnormal changes were observed. Compared with the normal group， the levels of ATP and MMP in the model group were decreased， the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with the normal group， the expressions of HSP70， ClpX and ClpP in the model group were all increased， while the expression of LonP was decreased， the differences were statistically significant （P<0.01）. Conclusion： The mechanism of liver tolerance to spleen qi deficiency is related to the enhancement of the quality control mechanism of mitochondrial protein in liver cells.

[Key words] Spleen qi deficiency Mitochondron Hot shock protein 70 protein Lon protease ClpXP complex

First-authors address： Graduate School， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.14.005

传统中医理论认为肝木克脾土，特别是脾虚易为肝乘，即“土虚木乘”，还指出脾气虚能扰肝，如“脾气虚则四支不用，五脏不安”。由此可知脾气虚不能改变肝克脾的规律，或者说肝对脾气虚具有一定的耐受性，但其现代医学机制不明。中西医对肝的形态描述基本一致，如位于腹腔右胁内、右叶大和左叶小等。现代医学认为肝脏是物质代谢的关键部位，而线粒体不仅是肝细胞的动力工厂，还广泛参与生物合成、信号转导和胞内钙稳态维持等，因此其健康对于肝至关重要。线粒体DNA突变率高，常导致其参与编码的线粒体蛋白错误折叠，但热休克蛋白70（hot shock protein， HSP70）能够对其再折叠实现修复，对于那些不能够被修复的错误折叠蛋白会被呈递给Lon蛋白酶（Lon protease， LonP）以及酪蛋白裂解酶（caseinolytic protease， Clp）XP复合物（ClpX和ClpP）等进行降解，笔者称这一系列的活动为线粒体蛋白质控（mitochondrial protein quality control， MPQC）[1-4]。之前有报道，当脾气虚时肝细胞线粒体功能损伤[5-6]，但是否与MPQC有关还不清楚。本文主要围绕肝细胞线粒体结构和功能及MPQC等，初步探讨肝耐受脾气虚的可能机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 研究起止时间2018年9月-2019年12月，选取16只SPF级SD雄性大鼠，体重190～210 g，鼠龄7周左右，购买于辽宁省本溪市的实验动物中心[许可证号：SCXK（辽）-2010-0001]，购进后在辽宁中医药大学的实验动物中心饲养[许可证号：SYXK（辽）-2013-000-9]。饲养条件：温度18～23 ℃，湿度45%～55%，自由进食，自由饮水。适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要仪器设备 酶标仪（America Bio-Rad）;日本电子透射电镜（JEM-1011）;转膜仪（美国Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo Transfer Systerm）;冷冻高速离心机（美国，Thermo Sientific，ST-16R）;电泳仪（美国Bio-Rad公司，042BR14173）;显影仪（上海天能科技有限公司，Tanon5200）。

1.3 主要试剂盒和抗体 ATP含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：201806）;JC-1膜電位（mitochondrial membrane potential， MMP）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：M8650）;总蛋白提取试剂盒（北京TransGen Biotech有限公司，批号：K21128）;BCA法蛋白含量测定试剂盒（北京TransGen Biotech有限公司，批号：K20316）;HSP70抗体（美国Proteintech公司，批号：00055287）;LonP多克隆抗体（美国Proteintech公司，批号：00022581）;ClpP多克隆抗体（美国Proteintech公司，批号：00023008）;ClpX多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：0001812Day77812）;Beta Actin Antibody（美国Proteintech公司，批号：66009-1-lg）;山羊抗兔二抗（北京TransGen Biotech有限公司，批号：M10327）;兔抗及鼠二抗（美国Proteintech，批号：20000002）;ECL化学发光试剂盒（北京TransGen Biotech有限公司，批号：M20926）。

1.4 方法

1.4.1 实验动物的分组、模型的复制和评价 16只SD雄性大鼠根据随机数字表法平均分成两组，即8只正常组（对照组）和8只脾气虚组（模型组）。模型组的大鼠按照文献[7]方法复制脾气虚证模型后对其进行评价，即15 d内进行5个循环的饥饿失常刺激（饱食1 d+禁食不禁水2 d）和每天力竭游泳，当出现少食、神疲、乏力和毛色枯槁时为造模成功。此实验的项目已经通过了辽宁中医药大学实验动物伦理委员会的审核（审核批准号：20151205）。

1.4.2 肝细胞线粒体的形态学观察 按文献[8-9]，冰上取部分肝脏组织，冰上切成约1 mm3小块，2.5%戊二醛固定后，按文献[10]方法对标本进行处理，透射电镜观察线粒体形态并拍照。

1.4 3 肝组织ATP和肝细胞MMP水平的检测 完成1.4.2后，按文献[8-9]，冰上取部分肝组织，采用比色法检测肝组织中ATP水平，JC-1法检测MMP，均严格按照说明书操作。

1.4.4 肝细胞MPQC相关蛋白表达 采用Western bloting（Wb）法。按1.4.2取部分肝组织，依照前期报道方法进行检测[8，11]，简要如下：200 mg肝组织加入500 μL裂解液后冰上充分研磨，静置10 min震荡1次，共震荡3次（静置30 min），4 ℃ 14 000 r/min离心10 min后取上清;BCA法测每个样本的蛋白浓度后，每管取上清50 μL加入等体积的2×SDS-PAGE，沸水浴中5 min，上样电泳，在分子量45处切胶、转膜（半干转）（25 V、30 min、1 A），5% BSA/TBST中37 ℃水浴封闭2 h;分别加入HSP70（1︰2 000）、LonP（1︰1 000）、ClpX（1︰800）、ClpP（1︰1 000）和Actin（1︰5 000），4 ℃摇床过夜;TBST溶液洗膜10 min×3次，除Actin外加入由HRP标记的山羊抗鼠二抗（1︰10 000）10 mL，其他加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1︰

5 000）20 mL，用TBST溶液洗膜后在膜上滴加发光液，曝光拍照后用Alpha View SA软件对数据进行处理。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞线粒体的形态学变化 两组线粒体大量分布于细胞核附近，形态相似，均呈卵圆形，边缘清楚，内部致密，未见到明显异常变化，见图1。

2.2 两组肝组织ATP水平和肝细胞MMP水平比较 与正常组相比，模型组ATP和MMP水平均下降，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。

2.3 两组肝细胞MPQC相关蛋白表达 正常组HSP70表达为（0.599±0.048），低于模型组的（0.966±0.035），差异有统计学意义（P<0.01）;正常组LonP表达为（1.020±0.087），高于模型组的（0.730±0.080），差异有统计学意义（P<0.01）;正常组ClpX表达为（0.836±0.090），低于模型组的（1.147±0.113），差异有统计学意义（P<0.01）;正常组ClpP表达为（0.940±0.024），低于模型组的（1.288±0.120），差异有统计学意义（P<0.01）。见图2。

3 讨论

脾运化水谷精微，以奉生身，而脾气虚则五脏不安。脾气虚对肝藏血、主疏泄的研究较多，而肝藏血与肝主疏泄相互依存，其现代医学基础离不开肝细胞的物质代谢和生物合成等作用[12-17]。因为线粒体不仅为肝细胞提供能量，还广泛参与肝细胞的上述活动，所以本研究观察了脾气虚时肝细胞线粒体形态和功能的变化。研究结果显示，两组线粒体在结构上没有明显变化，但模型组的ATP和MMP水平均明显降低，表明脾气虚时肝细胞的线粒体功能受损，但还未发生器质性病变。

ATP和MMP是线粒体氧化磷酸化反应的产物及先决条件，其水平异常与呼吸链功能紊乱有关。线粒体呼吸链位于线粒体嵴上，包括5种复合体，其中4种由细胞核及线粒体中的DNA进行双重的编码，但线粒体DNA极易发生突变，经常会导致相关蛋白结构异常，但受控于MPQC、线粒体动力学和线粒体自噬等机制，线粒体功能损伤通常不会过于严重。

研究发现，脾气虚大鼠肝细胞线粒体损伤与线粒体自噬紊乱有关[18]，但是否关联MPQC还不清楚。MPQC的主要作用是维持线粒体蛋白稳态，简单分为两方面作用：一是修复异常蛋白，主要由HSP70等重新折叠而恢复其正常结构;二是降解损伤蛋白，即通过LonP和ClpXP复合物等降解难以修复的异常蛋白[19-20]。

本研究观察到模型组的HSP70表达高于正常组，表明肝细胞修复异常线粒体蛋白的能力升高，错配蛋白可被及时修复;模型组LonP表达降低，ClpXP复合物表达增加，提示难以修复的异常蛋白可能不多，仅上调ClpXP复合物就能够清除。结合上述结果，可以推测脾气虚发生后肝细胞线粒体内的异常蛋白主要是被大量修复，而难以修复的也可以被降解进而清除，这个可能就是脾气虚组大鼠线粒体内部并没有见到明显损伤的原因。

上述结果提示，脾气虚时肝细胞线粒体功能出现了一定损伤，但同时肝细胞的MPQC作用增强，从而对抗脾气虚所造成的干扰。因此，本研究认为肝耐受脾气虚的机制与肝细胞MPQC增强有关。

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（收稿日期：2020-11-10） （本文編辑：姬思雨）