植冰技术在低温生物医学中的应用进展

李维杰,宋立勇,刘宝林

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

0 引言

细胞低温保存是广泛应用于现代再生医学、器官移植和辅助生殖的一项关键技术。根据两因素假说，细胞在冷冻过程中会发生溶质损伤[1-2]和胞内冰损伤[3]。慢速冷冻过程中，细胞受到较高浓度的溶质损伤，快速冷冻过程中，细胞脱水不充分，受到胞内冰损伤。在细胞低温保存领域，确定一个最佳的降温速率非常关键，既能降低溶质损伤，又能避免胞内冰损伤。冰核的开始是一个随机事件，它与溶液的过冷度密切相关[4-6]，溶液的过冷度取决于溶液的性质和工艺条件，过冷度很重要，它决定了冰核的数量，从而决定了细胞溶液中冰晶的数量和大小。根据热力学原理，当溶液过冷至熔点温度以下时，才会出现结晶现象。冰晶的生长过程是水分子在晶核表面形成氢键并有序排列的过程，水分子结晶包括两个过程，晶核的形成和冰晶的生长。晶核存在一个临界尺寸，晶核大于临界尺寸时冰晶才能进一步生长，晶核小于临界尺寸时则融化[7]。晶核临界尺寸和细胞溶液的过冷度有关，过冷度越高，晶核临界尺寸越小，溶液内部会形成更多稳定的晶核[8]。在低温保存细胞的过程中，存在一个最佳的降温速率，既能让细胞充分脱水，避免胞内冰损伤，又能避免过高的保护剂浓度的毒害。但在实际降温过程中，过冷度的存在会使得细胞溶液因释放潜热，温度上升，导致细胞的降温速率远高于最佳的降温速率，在较高的过冷度以及较高的降温速率下，会引起细胞不可控的结晶，细胞突然结冰，细胞脱水不充分，胞内冰大量生长，细胞大量死亡。本文综述了多种不同的诱导成核方法来降低过冷度，减小胞内冰的损害。

1 通过接触外壁形成局部过冷诱发成核

目前的理论认为，为了避免胞内冰损伤，我们通常不会采取快速冷冻的方法，细胞在快速冷冻的情况下，细胞内水来不及向外渗透就会结冰[2,9]。在慢速冷冻情况下，细胞有足够的时间脱去细胞内水分，但是这种情况通常会导致细胞长时间暴露于高浓度电解质的保护剂溶液中，也会导致细胞中毒死亡[1]，确定细胞的冷冻保存方案至关重要。胞内冰的形成还与水的过冷度有关，过冷度越大，细胞受到胞内冰的损伤越大。

接触外壁诱发成核的方案通常是将冻存管冷却到较高的零下温度，通过使用预冷探针，金属棒或手术钳来接触容器的侧面，从而提供局部过冷来诱发成核[10-11]，如图1所示。MAZUR[12]指出酵母细胞在-2.5 ℃时植冰的存活率高于在-16 ℃时自发冻结的存活率，此后，大量研究已经使用该方法来保存细胞[13-16]。较高温度下，植冰过程可以抑制胞内冰的形成，但是这种通过液氮预冷的手术钳去接触外壁的方式通常成功率不是很高，有时候需要多次接触才能实现，甚至可能失败。为了增加植冰的成功率，可以在冻存管或容器的底部增加一个金属贴片，然后再用预冷后的手术钳去接触该金属贴片，利用金属贴片的快速导热在溶液内部形成局部过冷点来诱发成核[17]。

图1 接触外壁形成局部过冷诱发成核[15]

当然,在低温显微镜下也可以完成接触外壁植冰的过程，为了在低温显微镜下观察细胞形态，通常会采取预冷探针或注射器针头接触载玻片上样品的方式完成植冰过程。YANG等[18]发现胞内冰总是优先在靠近细胞核的细胞膜产生，随着温度降低，胞内冰会从靠近细胞核的细胞膜上穿过细胞核，再逐渐传递到细胞质。没有经过植冰处理的细胞会产生细小的冰晶，经过植冰处理的细胞会产生较大的冰晶，并且不植冰产生的细小冰晶比植冰产生的大冰晶相比，更容易催化胞内冰的形成，这很可能是细小的冰晶更容易穿透细胞膜进入细胞质启动胞内冰的形成，这符合孔理论机理。这种细小的冰晶更容易穿透细胞膜，还可能跟细胞脱水的水运输有关[19]。虽然植冰技术对胞内冰影响的理论有很多猜想，但至今未能达到统一。通过接触外壁植冰的方式在细胞低温保存领域[13]和胚胎低温保存领域[20]有很大的应用。

2 通过添加冰成核剂诱发成核

通常溶液在低于熔点的温度下仍能保持液态，这种被称为过冷现象，液态水向冰转变的过程为成核和结晶的过程，这种促进其转变的物质称为冰成核剂。生物系统中存在很多冰成核剂，其中最普遍的为假单胞菌属、黄单胞菌属、欧文氏菌属。1974年MAKI等[21]首次在腐烂的树叶中发现了这种冰核细菌，这种冰核细菌可催化-1 ℃的过冷水冻结[22]。自冰核细菌可以作为冰成核剂以来，逐渐发现这种冰核细菌的主要影响因子是SNOMAX®，SNOMAX®是一种商品化的成核剂，SNOMAX®可以作为控制溶液结晶温度很好的工具，SNOMAX®的植冰作用不受低温保护剂或培养基中多种物质的影响，并且很少比例的SNOMAX®就可以降低溶液过冷度[23-24]。冰成核剂可以完全替代手动贴壁植冰，成功保存了蟾蜍卵母细胞和小鼠胚胎等[25-26]。

有机物中冰成核剂最常见的是蛋白质，蛋白质冰成核剂在较高的零下温度可以触发冻结[27]。DU等[28]发现生物体中溶菌酶在较高过冷度下也有促进冰成核的作用，溶菌酶可以降低成核相与外来粒子之间的界面自由能，它可以改变冰核形成过程中的界面动力学。

碘化银作为冰成核剂时，在低温保存中的应用也相对广泛。KOJIMA等[29]利用1%碘化银以连续抽吸的方式来诱导冰晶形成，或者利用海藻酸钠和氯化钙反应生成的海藻酸钙凝胶固定碘化银，将固定的碘化银浸入冷冻溶液中引发冰核，该方法成功保存了兔和牛胚胎[30]。其他类物质，如生物醇类物质也有发现冰成核剂的存在。MASSIE等[31]首次将类固醇类冰成核剂应用在肝细胞冷冻保存中，成功将肝细胞存活率提高至85%。醇类物质能被作为冰成核剂与碘化银成核机制相似[32]，理论认为醇类和碘化银能通过与冰的结构配合形成高效的冰核团，有效冰晶之间的晶格或结构匹配，形成有序的结晶簇。根据朗缪尔单分子层在诱导冰成核中的应用[33]，两亲体的压缩或未压缩单分子层均可促进单分子溶液界面的晶体定向生长。这种诱导是通过有核晶体的附着面与亲水头之间的结构配合或互补实现。

一般情况下，均相成核只存在于纯净水中，在低温生物医学领域，一般具备异相成核的条件[34]。冰成核剂在较高的零下温度提前诱发了异相成核，但是使用冰成核剂有一个缺点，即使可以在较高的温度下诱发成核，也无法控制在特定温度下成核，这不利于研究植冰温度对细胞存活率的影响。

3 通过电极头诱发成核

直接电冻结的方法是一种外部冷冻方法，它是将溶液冷却到所需的较高的零下温度，打开电源，在电极两端施加一定的电流脉冲，促进浸在电极里的溶液成核，并进一步结晶。1951年RAU[35]首次报道了施加在金属电极上的高压可以在过冷水中引起成核。此后的研究主要集中在电流强度、电极头材料的选择以及电极端口的设置[36-37]。对于直接电冻结装置虽然能允许许多样品的冰核化过程。但是，无论是细胞还是生物组织的低温保存，通常会在溶液中加入适量浓度的低温保护剂，而低温保护剂的添加会抑制电极成核,并且大量赋形剂像盐类物质，它的存在会抑制冰核。为了避免这种抑制作用，间接电冻结装置代替了直接电冻结装置，该装置通过高压电脉冲引发单独体积的纯水中诱导成核，生长的冰晶在通过狭窄的管子导入样品引发样品成核，该装置能实现独立于样品成分的冰核生成。PETERSEN等[7]首次将电极冻结应用在低温生物学中，该装置易于处理，成核效果好。与直接电冻结装置相比，这种设计使通过电极成核的冰晶独立于要保存的溶液，避免了溶液中添加剂对电极成核的影响，成核温度要比直接电冻结更高，但是只允许相同条件下冷冻8个样品。SPINDLER等[38]利用该电冻结装置成功诱导了人肺内皮细胞成核，得出在较高的成核温度下，可以大大降低低温保护剂的浓度，减小细胞低温保存中的损伤。

4 通过摇晃、振动和超声波等形式诱发成核

过冷液体中摇晃、振动以及超声波等形式都会诱发成核。针对超声波空化现象引起的空化冷冻成核的研究有3种理论模型：1）HICKLING[39]认为在空化气泡破裂的最后阶段会发生大于1 GPa的压力，由于气泡附近冰团的聚集，从而增加水的平衡冻结温度并导致冰成核；2）HUNT等[40]认为空化气泡破裂的负压会增加水的平衡冻结温度并导致成核；3）CHOW等[41]认为当空化气泡产生剧烈的循环运动，气体进出气泡以及周围的流体中形成强涡流时都会形成微流，微流可以增强伴随冷冻过程的传热和传质过程，溶液达到一定过冷度，可能会触发成核。上述3种理论模型中，空化气泡在冰的成核中起着重要的作用。

目前已经将超声波成核应用于新鲜食品的冷冻保存，冰淇淋制造，珍贵食品、维生素和营养物的保存，药物、疫苗的冷冻浓缩和冷冻干燥过程等。在低温生物医学领域，超声波植冰技术也有潜在的应用，超声波植冰技术可以被确定用来药物冻干，减少蛋白质冻干过程中的时间，并且可获得较高的酶活性[42-44]。关于超声波植冰技术机理的研究众说纷纭，其中就第一种理论模型的证明居多。SACLIER等[45]通过引入额外的动力学表达式来表达由于超声辐射引起的成核机理，提出了利用超声模拟冷却结晶过程的模型，该机制认为，空化气泡分裂的最后阶段出现的极高压力会增加水的平衡冻结温度，从而增加过冷度，而过冷度是冰核化的驱动力[46]，这与第1种理论模型一致[47]。ZHANG等[48]认为不能仅通过常规模型来解释传统模型中空化气泡的破裂触发了冰的成核作用，液体中大小不同气泡分布的水不能代替空化气泡。空化气泡引起的多次成核事件已经被研究的很多，但是对单个成核的详细观察少有研究，OHSAKA等[49]发现了一种技术，可以产生1个单一气泡，并且可以维持较长的时间。他观察到在过冷水中空化气泡可以引起冰成核。该研究也证明了成核是由于气泡破裂相关的高压脉冲引起的凝固点移动造成的。

在超声波作用下，冰的成核始终会发生在较高的零下温度，成核温度对冰晶生长状态有很大的影响，较低的成核温度可获得大量的小冰晶，较高的成核温度可获得大而定向的冰晶，这在细胞低温保存领域有很大的应用前景。

5 通过改变降温速率诱发成核

该方法也可以称为改变降温速率骤冷的方法，先以较慢速度进行降温，突然以较快的降温速率降温，造成局部温度差异，形成局部过冷，促进成核。在低温生物医学领域有一定的应用，该方法适用于细胞的冷冻保存。与新鲜细胞相比，DIENER等[50]利用此方法保存了大鼠肝细胞，并获得较高的成活率，酶活性无显著差异。这种突然降低降温速率的方法实则是给溶液一个较大的冷却冲击，在温度稍微高的溶液中产生一个局部过冷诱导成核，生物反应器冷冲击也是利用了这个原理，能够保存大量哺乳动物细胞系和组织等[51-52]。

6 通过惰性气体改变压力或者结合冰雾技术诱发成核

通过惰性气体先加压再迅速减压，从而在小瓶的液体表面形成冰核，这在低温冻干领域有一定的应用[53-54]，冰成核的主要驱动力被认为是由于突然减压引起的振动扰动，通过冷气接触表面冷却以及在突然减压期间液体表面的局部蒸发引起[55]。

“冰雾”技术是在潮湿的冷冻干燥机中填充冷气体，以产生小冰粒的蒸气悬浮液，当这些冰粒接触每个小瓶内的流体界面时，它们会诱导成核的技术[56]。结合减压技术，减压冰雾技术可以显著降低过冷度，在较高的零下温度实现成核[57]。

7 结论与展望

本文研究了植冰技术在低温生物医学领域的应用，分析了6种不同植冰方式的研究进展，得到如下结论：

1）目前植冰方式主要分6大类，即通过接触外壁形成局部过冷诱发成核，通过添加冰成核剂诱发成核，通过电极头诱发成核、通过摇晃、振动以及超声波等形式诱发成核，通过改变降温速率诱发成核，通过惰性气体改变压力，或结合冰雾技术诱发成核；

2）添加冰成核剂、超声波诱导、改变降温速率以及改变压力诱导等方法有一个缺点，无法控制在特定温度下促进成核，这不利于探究植冰温度对细胞存活率的影响；

3）植冰技术的研究得到了很大的突破，在很多方面都提出了一些新的技术和改进，但都存在一些不可控的因素和缺点,还需要进一步研究。