引导组织/骨再生牙周功能梯度膜的研究进展

赵文俊 陈宇

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院病理科 成都 610041

功能梯度材料（functionally gradient materials，FGMs）是20世纪80年代末由日本学者提出的材料制造的新概念，主要应用于工业[1]。近年来，随着材料科学和生命科学的不断进步，出现了将FGMs应用于生物医学领域的新发展。材料功能梯度化是材料发展的重要方向，指一种或多种复合材料组成的，在组成或结构等方面呈连续或梯度变化的新型材料，能满足在极限环境下正常工作的需求[2]。它的设计制造基于性能随材料内部位置的变化而变化，使材料的整体性能得以提升。该材料所展现的优良性能不仅受到工业界、材料界的高度重视，而且在生物医学领域也有初步的应用并展现了广阔的前景，如钛种植体的表面涂层、人工心脏瓣膜、人工关节及骨连接体等[3]。

牙周炎、创伤及肿瘤常常导致牙周组织缺损[4]。引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR）是修复牙周组织缺损的有效方法，已被广泛应用于临床，其原理是将具有适当形状物理屏障膜放置于特定缺损位置，以覆盖再生过程所在的区域；膜将上皮和牙龈结缔组织细胞从缺损区域中隔离，在下方形成相对封闭的空间，并引导牙周干细胞优先定植在暴露的牙根表面，促进牙骨质、牙周膜及牙槽骨的生长，以实现牙周组织再生的目标。目前，GTR代表了获得牙周组织再生的最佳方法，能有效促进新的牙周组织和骨质的形成。随着种植修复广泛开展，将GTR技术用于种植体周围骨缺损的修复称为引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）。GTR/GBR技术中的关键环节就是生物屏障膜（biological barrier membrane，BBM） 的运用[5-6]。作为物理屏障，BBM主要作用是阻挡牙龈结缔组织和上皮向缺损处生长，提供并维持相应成骨空间，为牙周组织的再生及种植体周围骨缺损的修复创造一个相对密闭的有利空间。

然而，越来越多的细胞和分子学研究[6-7]表明，在GTR/GBR过程中，BBM不仅仅是被动屏障，更是生物活性空间，应有意识地调整膜的组成和结构以增强GTR/GBR。目前，基于FGMs理念，用分级结构生物材料制作方法所构建的用于牙周GTR/GBR的膜——功能梯度膜（functionally gradient membrane，FGM），将是一种空间维持、功能分级和生物活性的生物材料，结合纳米技术及搭载多种生物活性药物和因子，能使膜更好模拟细胞和组织微环境，促进细胞的黏附、增殖和所期望的方向分化，达到优异的仿生效果，从而促进牙周再生[8-12]。

1 牙周FGM的设计要求

理想的GTR/GBR膜应具备以下特点[13-14]：有一定的柔韧性，易于植入手术操作；良好的生物相容性，降解产物无毒性作用，不干扰组织的再生；有一定的机械强度，维持组织再生所需的空间；降解速率可控性，降解时间与组织再生过程相协调（对于GTR至少在4～6周内保持5～8 MPa的强度，对于GBR应保持24周以上）；具有良好的细胞及组织亲和性，选择性的引导组织细胞再生及定向分化。

然而，目前的膜均未达到“理想”的要求。目前运用于临床的商业化膜主要有第1代不可吸收膜（如聚四氟乙烯膜）和第二代可吸收膜（如胶原膜、人工或天然聚合物膜）[14-15]。第1代生物膜性能优异，但需要二次手术取出，干扰了新生牙周组织的形成和增加患者的痛苦；目前的可吸收膜具有易降解及生物活性不强等许多结构、机械和生物功能的限制，不能满足牙周再生治疗的需求。

FGM制作基本原理是设计一种膜，可以定制不同层的特性，使膜能保持足够长时间的结构、尺寸和机械完整性，以促进组织再生[16]。作为界面植入物，GTR/GBR膜的外侧与牙龈结缔组织及上皮接触，内侧与牙周膜细胞及牙槽骨组织接触。为了实现良好的牙周再生，临床期望膜的多方面性能得到提升，主要为：外侧面能促进软组织生长愈合，并能阻止口腔细菌的定植；与骨组织及牙周膜接触的内侧面具有良好的促成骨能力，诱导牙周膜细胞及前成骨细胞的成骨向分化；在实现良好生物功能的同时能够维持一定时间的机械强度，为下方的组织再生维持良好的空间，在完成组织再生前不随着膜的降解而变形坍塌。

基于牙周GTR/GBR的原理及FGM的制造理念，学者们[16]设想将这种界面植入物设计成具有成分和结构呈梯度或连续变化的结构（图1），促进骨生长、防止口腔细菌浸润及牙龈组织向下方组织缺损区生长，使膜的特性愈趋于“理想”，以满足局部功能要求，使膜多方面性能得以提升，实现更优良的组织再生。

2 FGM的种类及其分层形式

2.1 经典多层形式

Bottino等[17-18]设计了具代表性的一种新型多层FGM，通过静电纺丝制备，包括3部分，共5层（图2）：分别是核心层（core layer，CL）和2个具有生物特异功能的表层。1）CL：其主要作用为维持膜的力学强度，抵抗外来应力，为了牙周组织再生创造一个相对稳定、密闭的空间。为了和功能性表层形成逐渐过渡，将CL进一步细化成3层结构；2）表层：表层主要的作用是发挥特定的功能作用，面向牙龈软组织侧的表层可促进软组织的再生愈合，防止口腔微生物的定植；面向骨缺损的表层可诱导相对封闭缺损区的干细胞等成骨向分化，促进新附着及新骨的形成。

CL和具有特定生物功能的表层，形成化学组成及机械性能呈阶梯变化的一个整体结构。从中心向表层，生物学性能逐渐增强，而力学强度逐渐下降；然而，从表层向中心，力学强度逐渐增强，而特异的生物学性能逐渐下降[17]。FGM具有将诸多所期望的性能集于一体的优良设计，为更优异的功能性GTR/GBR膜的开发提供了新的思路和方向。

图 1 FGM呈阶梯或连续变化示意图Fig 1 Diagram of FGM showing ladder or continuous change

图 2 Bottino MC设计的FGM结构示意图Fig 2 FGM structure diagram designed by Bottino MC

2.2 三层膜

三层膜结构虽然并不完全符合FGM的要求，但其制作相对简单，设计也体现了FGM的部分特征。Teng等[19]采用溶剂浇铸法和蒸发法制备了不同比例的纳米羟磷灰石/壳聚糖（nano hydroxyapatite/chitosan，n-HAp/CS）复合膜，3层结构膜的顶层和底层均由含20%羟磷灰石（hydroxyapatite，HAp）的胶原组成，中间层由CS组成。Ku等[20]制备了CS和聚乳酸（polylactic acid，PLLA）组成的3层膜，该膜由2个CS网状外层和1个PLLA纳米多孔中间层组成，CS纤维网的外层具有高度的生物相容性和粗糙的表面，便于细胞黏附，PLLA层旨在为防止上皮细胞侵袭，体外降解和细胞学实验结果表明CS/PLLA膜具有良好的生物相容性和机械稳定性（膜保持其完整性长达8周）。

2.3 变异形式

在经典的FGM出现以前，学者们合成了大量的双层、不对称性膜等结构，这些形式可视为FGM的前体或变异形式，其构造理念在功能和作用上已经逐步向FGM靠近。Bio-Gide膜为临床最常用的商品化胶原膜，由猪的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维组成的，为双层结构，外层致密光滑和内层呈多孔；当用于GBR时，多孔层可以使成骨细胞迁移，促进骨生长，同时致密层可以防止成纤维细胞侵入；据观察，Bio-Gide膜可迅速吸附自体骨碎片释放的生长因子，有助于GBR[14]。有学者[21]用静电纺丝法制备双层生物活性膜，其中1层使用聚癸二酸甘油酯/聚己内酯/β-磷酸三钙（polygly-col sebacate/polycaprolactone/β-tricalcium phosphate，PGS/PCL/β-TCP）制备生物活性层提供GBR，另一侧使用PGS/PCL/CS三元混合物纺丝层来促进牙周的愈合。Ma等[22]利用液氮淬火和冷冻干燥相结合的方法来制备不对称CS膜，并用三聚磷酸钠进行交联，交联可使膜的一侧较另一侧更加致密，得到双侧密度不对称的膜，同时膜的力学性能也得到加强。

3 合成方法

梯度功能的材料制作理念首先产生并较早的应用于机械工程领域，合成方法种类繁多，有电镀和电泳法、电铸法、化学镀法、粉末冶金等方法。由于生物医学领域的生物相容性、生物安全性等特殊要求，其对原材和制备方法的要求与工程领域有所差异。FGM常有以下合成方法，也有多种方法的复合。

3.1 静电纺丝

静电纺丝的纤维可达到纳米水平，广泛应用在组织工程及再生组织领域[23]。Bottino等[18]采用静电纺丝法逐层堆叠制备的FGM。CL由3层组成，包含1个纯聚D，L-乳酸-co-己内酯PLCL层［poly（D,L-lactic acid co caprolactone），PLCL］ 以及由明胶、PLCL和PLA混合物组成的2个复合层包围。PLCL具有特殊的弹性，使膜有利于折叠、裁剪和缝合等，这是膜能够在体内植入的关键环节。CL主要承担着FGM在体内的机械性能的，可根据其预测膜在体内的降解时的机械性能变化。在水化条件下，CL表现出较高的拉伸强度（8.7 MPa）和拉伸模量（156 MPa），破坏应变为375%。未观察到膜分层，预示在生理条件下，分级结构保持完整。2层富含蛋白质复合层的加入降低了膜的拉伸性能，拉伸强度为3.5 MPa，拉伸模量为80 MPa，断裂应变为297%。功能表面层包含内、外表面层，内侧骨界面，包含n-HAp；外侧上皮界面，包含甲硝唑（metronidazole，MET）。

3.2 溶液浇铸

有学者[23-24]制备的三层膜，由聚乳酸-co-乙醇酸 ［poly（lactic acid co glycolic acid），PLGA］、纳米碳酸羟磷灰石（nano hydroxyapatite carbonate，nCHA）和胶原组成，即：nCHAC/PLGA，通过逐层浇铸法，分别为内侧8% nCHAC/ PLGA，中间层PLGA/4% nCHAC 和外侧PLGA，内侧多孔侧允许细胞黏附，外侧PLGA层为光滑无孔，阻止细胞黏附。还有学者[25-27]采用溶液浇铸并结合热诱导相分离及溶剂浸出技术，制备了由不同比例PLGA/n-HAp/月桂酸（lauric acid，LA）组成的3层复合膜，LA为长链饱和脂肪酸，具有抗菌作用，采用热诱导相分离工艺可调整、平衡膜的机械性能（硬度和弹性），使膜的机械强度增强，抗拉强度从1.54 MPa上升到2.27 MPa以上。 Leal等[28]通过调整溶液浇铸法制备膜，促进无机组分生物玻璃（bioglass，BG）沿膜厚度不均匀分布，复合膜的BG富集面能更多的诱导磷酸盐缓冲液中骨样磷灰石沉淀，表明这种生物膜具有不对称的骨传导特性。

3.3 其他方法

制作生物医学功能梯度材料的其他方法有离心法、混合、激光加工、放电等离子烧结、控制盐晶体作为成孔剂的比例、3D打印、熔融沉积法等[2]。Almasi等[29]首次采用电泳技术来控制四环素（tetracycline，TCH）在PLA溶液中的分布，待溶剂挥发后成膜，结果表明，利用电泳力，可以使更多的TCH在薄膜顶面聚集，从顶面向底面浓度依次降低，形成浓度梯度，同时，抑菌实验表明，TCH含量较高的薄膜样品表面的对大肠杆菌的生长有更好的抑制作用。也可以使用2种或2种以上的方法复合。有学者[30]用PLGA制作双层膜，采用浇铸法制备了致密层，然后用气纺在其表面制备疏松的纤维层；致密层防止上皮组织长入，疏松纤维层支持细胞定植和骨再生，维持屏障功能达16周，动物实验显示了比胶原膜更好的成骨性能。学者们[31-32]应用功能梯度这个理念，设计FGM的不同层，这些膜可以组合在一起成为整体，作为GTR膜，他们使用了冷冻凝胶和静电纺丝技术，并对各层进行了完整的表征，并建议将其用于功能梯度结构。

4 FGM改性方向

4.1 仿生学改性

仿生是再生领域的重要研究方向，梯度性质的生物聚合物材料能在形态、结构、组成等方面模拟天然细胞外基质、细胞和组织微环境，更有利于组织再生[8]。体外研究表明[33-36]：膜的表面形貌、化学成分和孔隙结构可影响多种细胞的增殖。研究[34]发现，纳米形貌影响细胞黏附、迁移、增殖和分化等生物行为，取向排列的纤维形态导致细胞形态方向高度一致。由生物相容性和可降解的天然或合成材料组成的聚合物或混合物，通过静电纺丝所产生的纳米级至亚微米级纤维膜，类似于天然细胞外基质的组成和排列方式[31]。

4.2 抗菌改性

抗菌性能是GTR/GBR中有必要加强的环节，炎症刺激会影响新组织的生长，GBR失败常源于膜暴露于口腔时细菌污染所导致[4-5]。控制或减少牙周缺损处病原微生物对促进牙周再生至关重要。口服抗生素作为牙周病的辅助治疗药物，有助于减少或消除牙周病原体，为防止耐药性等问题，研究人员设计了能够控制和局部输送药物的膜材料[37-39]。

Bottino等[18]设计的FGM中，将25%MET加入到上皮组织侧的界面层中，即PLA/明胶/25%MET。将TCH通过共混或同轴静电纺丝结合到PLLA纤维中，通过体外释药评价表明，由核-壳纤维加工而成的纤维比混合纤维具有较低的早期突释和更持续的释放，这对于避免细菌感染具有重要价值[39-40]。一种新开发的纳米银-羟磷灰石-钛/聚酰胺 （nano silver hydroxyapatite titanium/polyamide，nAg-HAp-TiO2/PA）纳米复合材料的GBR膜，nAg具有抗菌作用，此膜比膨体聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene，e-PTFE）膜具有更高的碱性磷酸酶水平，更高的成骨活性，在体内8周后，nAg-HAp-TiO2/PA和e-PTFE组均出现骨缺损的完全闭合[41]。Chou等[42]报道了2种市场销售的可生物降解膜，即Resolut Adapt LT（一种聚酯基膜）和Bio-Mend Extend（一种Ⅰ型牛胶原蛋白）经磷酸锌矿化后的抗菌效果，发现与未矿化膜相比，磷酸锌矿化导致伴放线放线杆菌活性显著降低。

4.3 促成骨改性

成功的牙周再生有赖于材料与其他因素如生长因子、细胞和血液供应之间的精确相互作用[17]。目前，骨移植材料、外源性生长因子和细胞为基础的治疗方法的应用已经促进了GTR/GBR[43-44]。局部提供多种生长因子，如富含血小板的血浆（platelet rich plasma，PRP） 和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），通过调节细胞活性和刺激细胞分化来合成细胞外基质以形成新组织，从而促进牙周愈合和再生。

骨移植材料如n-HAp、β-TCP、BG等，有良好的骨传导性和骨诱导性，已被公认为是骨组织构建的关键成分，在开孔骨支架中，通过吸引骨细胞迁移来实现组织渗透，从而使支架具有更好的生物整合性[45-47]。许多学者[46-47]研究了n-HAp颗粒在体外对骨组织再生的影响。Liao等[24]发现，n-HAp的加入提高了膜的生物相容性和骨传导性。Yang等[46]制作的静电纺丝膜由n-HAp和PCL组成，这证实n-HAp的掺入在提高膜生物活性和促进早期细胞分化，使细胞具有更好的黏附和增殖能力，可增强胶原与聚合物的共静电纺丝膜的机械性能。

5 总结与展望

基于先进的设计理念，FGM能形成理化性能、结构、生物性能的连续或梯度结构，不仅更好地将材料各组分的性能得以展现，同时能搭载更多的因子或成分，并结合纳米技术、静电纺丝等技术，多方面提升和优化材料的整体性能，将仿生组织工程技术推向更高的地位，极大限度地促进GTR/GBR。然而，FGM还有以下方面有待进一步发展和改进：1）需要较复杂的制作工艺和设备，限制了其较大规模的生产和应用；2）其性质不同于简单组分和结构的材料，尚未有成体系的评价标准；3）其内部各组分和结构的相互影响，一定程度上增加了其性质的多变性。

总之，目前FGM仅以少量变异的形式应用于临床，有一些有待改进和发展的方面，但比结构功能单一的传统膜更具有明显的优势，有望对GTR/GBR产生重要的促进作用，有更大的临床应用前景。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。