杜鹃属ISSR-PCR 反应体系优化

赵丽华，李 强

（1 西昌学院农业科学学院，四川西昌 615000；四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000）

ISSR（inter-simple sequence repeat）是一种DNA 分子标记技术，其原理和操作与SSR、RAPD 非常相似，但其产物多态性远比SSR、RAPD、RFLP 更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，且操作简单、重复性好、多态性丰富、DNA 样品用量少和成本低的特点。目前已应用于枇杷[4]、观赏桃[5]、龙荔[6]等植物的遗传多样性研究、品种鉴定等研究中。但是ISSR-PCR 反应体系的质量往往受到DNA、引物、Tap DNA 聚合酶、Mg2+等的浓度影响[4-6]。本研究旨在对杜鹃属植物ISSR-PCR反应体系进行优化，以获得良好的试验结果，为进行杜鹃属植物种质鉴定、遗传多样性研究、分子标记辅助育种等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以“毛叶杜鹃”为供试材料。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试剂。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL 2000 购自TaKaRa 有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 仪器。Eppendorf Mastercycler Gradient PCR 仪、六一厂DYY-8B 型电泳仪、复日FR-200A 全自动紫外与可见分析装置等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取及检测。应用CTAB 法提取“毛叶杜鹃”叶片基因组DNA[6-7]，稀释为100ng/μL 工作液，放入4℃冰箱里备用。

1.3.2 ISSR-PCR 体系优化。以UBC811 为引物，对“毛叶杜鹃”叶片基因组DNA 进行PCR 扩增。对影响PCR反应的Taq DNA 聚合酶、Mg2+、引物、模板DNA 浓度进行正交试验设计L9（34）（表1），按表1 编号加样后，每管加入2.0μL 的10×PCR buffer，用灭菌后的ddH2O补足20μL。每个处理重复1 次。

表1 ISSR-PCR 反应体系正交试验设计L9（34）

参照潘丽梅等[6,8-10]的设定扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，退火1min，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

采用2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物，用紫外与可见分析装置观察并拍照记录。根据电泳的正交试验结果，对各处理进行综合评定。

根据电泳的正交试验结果，选出正交试验结果中较佳PCR 体系组合，再在此体系基础上进行UBC820引物单因素调整（表2），按表2 编号加样后，每管加入2.0μL 的10×PCR buffer，用灭菌后的ddH2O 补足20μL。

表2 单因素调整表

1.3.3 ISSR-PCR 反应体系稳定性检测。根据正交试验结果筛选出最佳体系，对5 个杜鹃属植物种DNA 进行ISSR-PCR 扩增，2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物，检测ISSR-PCR 反应体系稳定性。

2 结果与分析

2.1 ISSR 反应体系优化

按表1 正交设计的9 个处理进行PCR 反应后，电泳结果如图1 所示。图1 显示：在9 个处理中，扩增效果存在着明显差异。经综合评定处理1、2、3 的扩增DNA 条带数较多，但背景弥散较严重，其中处理2、3的扩增DNA 条带数多于处理1，并且亮度较高。处理4、5、6、7、9 背景较弥散较严重，且DNA 条带数较少。处理8 条带数较少，且背景弥散。综合扩增的DNA 条带数及背景弥散程度，处理2、3 相对扩增效果较好。

图1 正交设计试验PCR 产物电泳图

以处理2 为基础，调整着引物浓度，电泳结果如图2 所示。在9 个处理中，处理a、b 的DNA 条带数较多，但背景弥散较严重；处理c、d、f、h 背景干净但条带数较少；处理i 没有清晰的DNA 条带，且背景弥散；处理e、g 的背景轻微弥散，DNA 条带数较多且清晰，处理e的综合效果优于处理g。

图2 单因素调整试验PCR 产物电泳图

2.2 ISSR-PCR 反应体系稳定性检测

根据体系优化试验结果，用引物UBC 810 对5 个杜鹃种进行PCR 扩增，电泳结果显示（图3）：扩增谱带清晰，背景弥散轻，多样性丰富，表明所建立的杜鹃属ISSR-PCR 反应体系稳定可靠。

图3 UBC 810 对部分杜鹃的PCR 扩增结果

3 讨论与结论

ISSR-PCR 反应体系中 的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 等各因素都会影响PCR 产物的稳定性，而且不同物种的最佳ISSR-PCR 反应体系也不相同。因此，应先对ISSR-PCR 反应体系进行优化，以保证试验结果的可靠性[11-12]。Mg2+浓度不仅影响Taq DNA 聚合酶活性，还能影响引物与模板的结合效率、模板与PCR 产物的解链温度。引物浓度过低，则不能进行有效的扩增；引物浓度过高，则会引起错配和非特异性扩增。Taq DNA 聚合酶浓度过高，反应特异性降低。模板DNA 浓度过高，则导致引物或dNTPs 过早耗尽，出现非特异性扩增，产生弥散；DNA 浓度过低，则反应产物减少，会使扩增的条带变弱[13-14,16]。本研究采用正交试验设计L9（34）进行DNA 模板、引物、Taq 酶、Mg2+不同浓度水平组合，试验结果显示：正交试验设计L9（34）不同组合间，扩增效果存在着明显差异（图1），其中2、3反应体系综合效果最好，但背景弥散仍较严重，而正交试验设计L9（34）中引物浓度已为最低，在此基础上对PCR 引物再进行单因素的调整，确定杜鹃属植物ISSR-PCR 的20μL 最优反应体系为：Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA 聚合酶1U、模板DNA 20ng、引物0.9μmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、1×PCR buffer。可为ISSR 技术对杜鹃属植物进行遗传分析以及辅助育种提供参考。