高效纤维素复合菌剂对玉米秸秆降解效果的研究

朱 琳，张思月，冯佩瑶，孔庆辰，陈 琦，钟为章

（河北科技大学 环境科学与工程学院，河北 石家庄050018）

0 引 言

根据《中国统计年鉴》（2019年版）数据显示，全国主要农作物秸秆产量高达861万t，产量巨大。其中大约31%的秸秆被露天燃烧、还田和随意丢弃，这种处理秸秆的方式在我国普遍存在，每年总量高达约2亿t的作物秸秆被浪费，同时也引发了温室气体的大量排放，以及农作物病虫害的增多等严重的环境问题。

秸秆是潜在的生物质能源的来源，若将其进行有效利用，不仅能减少因室外秸秆自然腐败而生成的甲烷等温室气体的排放，还能获得清洁能源甲烷和沼渣、沼液等有机肥料，从而有效地缓解现今的能源危机和解决环境污染问题。

厌氧消化技术是目前普遍使用的处理技术，是一个非常复杂的生化反应过程，受到相互藕合、相互作用等多重因素的影响。由于厌氧消化技术对纤维素类生物质难以降解，因此，需对农作物秸秆进行预处理。

目前，已有的预处理方法中机械或物理法、以及化学与物理化学法的能耗较高，且存在不同程度的环境污染。

相对而言，生物预处理法具有能耗低、环境友好的优点，符合现今社会提倡的绿色经济、循环经济以及低碳经济的要求，但其缺点也明显，预处理时间和生产周期较长，产气率低，因而限制了工业化的应用。

近年来，国内关于生物法预处理秸秆生物质制沼气的研究较多，处理秸秆主要是玉米秸秆、小麦秸秆和稻草等。所用微生物菌种大多数是筛选出的单菌株，而使用复合菌系的不多，因此效果不是很理想。

刘思颖从腐木中分离获得一株短小芽孢草杆菌属J33，将其用于预处理稻草秸秆进行发酵产气实验，在发酵20 d后，产气量比自然堆沤处理的秸秆总产气量提高了26.7%。

国外关于生物法预处理秸秆生物质后用于制取沼气的研究较少，主要底物是作物秸秆和能源草等，其中使用担子菌类处理的较多。

Ghosh等人利用白色腐败菌和褐腐菌来处理稻草，最大沼气产率为479.40 L/kg干物质，甲烷产率分别达到了327.90、430.95和295.95 L/kgTS，而未处理组仅为355.8 L/kgTS和224.3 L/kgTS，甲烷产率分别提高了46.19%和31.94%。

本实验模拟自然条件下纤维素的分解过程，利用微生物之间的协同关系，根据酸碱互补原则，组合优化酸碱反应不同的纤维素降解菌群，通过纤维素酶活测定，菌系复筛，筛选制备出稳定高效降解纤维素的复合菌剂。

这种复合协同的预处理菌剂，可以有效地破坏木质素的密封，打乱纤维素的结晶结构，即减少木质素的抗性和不透性，从而使生物质中的纤维素和半纤维素易被微生物水解和转化为单糖，加快启动，大大缩短了处理的时间，进一步提高了生物质产沼气的效率，从而实现了循环经济、绿色经济和低碳经济。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 玉米秸秆

试验采用玉米秸秆，先用铡刀将秸秆切割成小段（1～3）cm，干燥后用粉碎机粉碎，用40目筛过筛，取筛下物于干燥通风处待用。

1.1.2 微生物复合菌剂

本研究所用微生物复合菌剂为本课题组前期研究开发得到，其中成分和制作方法见相关专利。

1.1.3 试验用培养基

（1）蛋白胨纤维素培养基（PCS）。

（2）基础培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；马铃薯葡萄糖培养基（PDA）；高氏合成一号培养基。

（3）筛选培养基：羧甲基纤维素钠培养基；滤纸条培养基；刚果红纤维素培养基。

（4）发酵培养基：发酵培养基。

1.2 实验方法

根据对秸秆生物质成分的分析与特点对比，通过生物质预处理、厌氧消化技术等的综合运用，生产出环境友好型沼气能源。

以农作物秸秆或处理后的材料为原料，进行产品的更新和创新，主要研发一种高效纤维素降解复合菌剂，优化厌氧消化技术，从而将秸秆转化为生物燃气和有机肥料进一步加以利用。

1.2.1 纤维素（CMC）酶活的测定分析

纤维素酶活的测定参考中国人民共和国国家标准QB2583-2003。

（1）试剂。

①DNS试剂。

②0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液。

（2）葡萄糖标准曲线。

①1 mg/mL葡萄糖标准液。

②标准曲线绘制。

③以吸光值OD540值为横坐标，葡萄糖含量（μg）为纵坐标作出标准曲线。

(1)生成k个满足假设5和假设6的随机整数xk，表示第k个时间段乘坐电梯的人数，并将xk个人随机的分到第l楼；

葡萄糖的标准曲线如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

（3）粗酶液的制备。

培养5 d的发酵液20 mL，在温度为4℃，转速为8 000 rpm的条件下，在高速离心机中离心15 min，取上清液，即为粗酶液。

（4）CMC酶活测定。

将稀释至合适浓度的酶液0.5 mL，加入到1 mL质量分数为1%的CMC溶液（溶于0.1 mol/L，pH=4.8的HAc-NaAc缓冲液中）中，水浴锅50℃下恒温30 min，再加入1.5 mL DNS试剂，置于沸水浴中5 min，冷却，稀释至25 mL，在540 nm下测吸光度值。

每min水解1%的CMC溶液产生1μg葡萄糖的酶量定义为1个CMC酶活力单位（U）。

根据测得的吸光度值在标准曲线查出对应的葡萄糖含量（μg），按下式计算CMC酶活力：

1.2.2 高效纤维素降解菌的复筛

将筛选出的纤维素降解菌株在刚果红纤维素培养基的中央进行点接种，之后，置于常温25℃下培养，分别记录水解圈和菌落的直径。

根据水解圈直径（d）和菌落直径（D）得到d/D的比值。d/D越大，说明其纤维素分解能力越强，生长速度越快。

1.2.3 高效纤维素降解复合菌群的构建

将筛选出的所产纤维素酶活较多的菌株，按正交试验设计表进行混合，然后接种到装有100 mL液体的发酵培养基的250 mL三角瓶中，放置于恒温振荡器中，在温度为25℃，转速为150 rpm条件下恒温培养，观察培养基中的滤纸条分解情况，确定效果最佳的高效纤维素降解复合菌群。

2 结果讨论与分析

2.1 扫描电镜（SEM）观察

对未预处理和经过高效纤维素降解复合菌剂预处理的作物秸秆进行了电镜扫描，观察其微观表面形态，以便从微观形态上直观地了解生物预处理前后的玉米秸秆的纤维组织的变化情况。

不同生物预处理时间的玉米秸秆的电镜扫描照片如图2所示。

图2 不同生物预处理时间的玉米秸秆的电镜扫描图像Fig.2 SEMimages of corn straw with different biological pretreatment times

由图2（a）可以看出，未预处理的秸秆表面比较完整光滑，纤维组织排列有序，结构致密，无明显的破损和孔隙。

由经过复合菌剂预处理后的图2（b）和（c）可以看出，作物秸秆的表面粗糙，凹凸不平，疏松多孔，出现了明显的裂纹、裂片，甚至呈蜂窝状，这说明其中的纤维素、半纤维素和木质素的结构遭到了部分的破坏和分离，纤维和纤维束出现了卷曲折叠，变得柔软疏松，排列凌乱。表面上出现的碎片状的物质很可能是其中的半纤维素和木质素溶出物。

由图2可以看出如下内容。

（1）玉米秸秆经过生物预处理后，原本致密、完整和有序的结构受到了严重的破坏，这使水解酶和水解菌与其深入接触的表面积增大，从而提高了水解效率，使水解这一厌氧消化的限速步骤得到了很好地解决。

（2）生物预处理玉米秸秆中的纤维素、半纤维素和其他有机物质能更容易地被厌氧消化和利用，其可利用性和生物降解性得到了显著提高。

2.2 X-射线衍射（XRD）分析

通过X-射线衍射（XRD）分析生物预处理对纤维素结晶度的影响，分析纤维素结晶度与生物质酶解抗性之间存在的关系。

未预处理和不同预处理时间的作物秸秆的X-射线衍射图如图3所示。

图3 不同生物预处理时间的作物秸秆的X-射线衍射图Fig.3 X-ray diffraction pattern of corn straw with different biological pretreatment times

由图3可以看出如下内容。

（1）经过复合菌剂预处理后作物秸秆的衍射图谱的形状基本与未经预处理的相同，没有发生根本的改变，只是存在强度上的差异。

（2）秸秆原料与经过复合菌剂预处理后物料的晶型结构为典型纤维素Ⅰ型，其XRD图谱均在2θ为16°和22°出现了典型的纤维素Ⅰ型的特征峰，生物预处理后，物料仅在两处的衍射峰强度减少，说明生物预处理并没有破坏秸秆物料的结晶结构。

（3）随着生物预处理时间的增加，在2θ为16°和22°附近的波峰的衍射强度越来越大。

2.3 纤维素、半纤维素和木质素含量变化与分析

未预处理和生物预处理的玉米秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素的含量见表1。

表1 不同生物预处理时间后的玉米秸秆中主要成分的变化Table 1 Changes of main compositions in corn strawafter different biological pretreatment time

由表1可以看出如下内容。

（1）未经预处理的玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素分别占玉米作物秸秆干物质含量的41.16%、28.13%和8.72%，三者之和占到玉米秸秆干物质量的78.01%。将其用于厌氧消化，是厌氧微生物生长的主要碳源，其含量和可生物降解性能对玉米秸秆的消化性能是最直接的决定因素，同时也决定了玉米秸秆的产气量的高低和厌氧消化时间的长短。

（2）经复合菌剂预处理后，玉米秸秆的纤维素、半纤维素和木质素含量都有了明显的降低，与未预处理的相比，5、10、15和20 d的总纤维素分别下降了5.44%、10.06%、21.27%和25.10%。由此可以看出，相当数量的木质纤维素被分解而生成了其它的成分。

（3）经过生物预处理的玉米秸秆的木质素与纤维素的比值均比未预处理的比值小，从另一方面反应出生物预处理后的玉米秸秆的生物降解性的增强。

（4）生物预处理作用降解了相当数量的木质纤维素，从而预处理后的玉米秸秆中木质纤维素的含量也降低不少，这样阻碍厌氧菌作用的物质越少，也越有利于其消化。

（5）纤维素和半纤维素随着木质素的去除而被释放出来，从而增加了纤维素和半纤维素中微生物的可利用的程度，使得被厌氧微生物更易接触和作用。

（6）木质素、纤维素和半纤维素这些大分子物质被转化成小分子物质，上述作用共同促进了玉米秸秆的消化性能，提高了其产气率。

2.4 每日生物气产量

未预处理与不同生物预处理时间的玉米秸秆的每日生物气产量如图4所示。

图4 未预处理与不同生物预处理时间的玉米秸秆的每日产气量Fig.4 Daily biogas production of corn straw untreated and different biological pretreatment times

由图4可以看出如下内容。

（1）每日生物气产量有着类似的趋势，未预处理与经复合菌剂预处理的玉米秸秆的主要不同是峰数、每日产气量值以及生物气产生的持续时间。一般而言，与未预处理玉米秸秆对照样相比，经预处理的玉米秸秆在更短的发酵时间内有更高的每日沼气产量。

（2）在第10 d出现了1个产气高峰，这说明生物预处理使能更好的被厌氧消化的成分增加了。

（3）经复合菌剂预处理样品的每日生物气产气峰数与产量值均比未预处理的多。

（4）经预处理后的玉米秸秆的产气性能出现了明显的加强。

经预处理后玉米秸秆的可厌氧消化的有效成分增多，从而在相同的秸秆量下有更多的生物气产量，即单位玉米秸秆的产气量得到了提高，也即玉米秸秆的利用效率得到了有效提高。

2.5 累积生物气产量

未预处理和不同生物预处理时间的玉米秸秆在30 d内的累积产气量情况如图5所示。

图5 未预处理与不同生物预处理时间的玉米秸秆的累积产气量Fig.5 Cumulative biogas production of corn straw untreated and different biological pretreatment time

由图5可以看出如下内容。

（1）各组玉米秸秆的累积产气量曲线趋势相似，但未预处理的累积产气量的曲线较平缓，说明其增速较缓慢。

（2）微生物预处理玉米秸秆在前15 d中累积产气量的增速较高，之后放缓，直到第20 d，变化幅度较小，而第20 d以后产气基本停止。

（3）在30 d里的不同时间，复合菌系预处理的玉米秸秆的总产气量均要明显高于未预处理玉米秸秆。其中，15 d和20 d生物预处理的玉米秸秆的累积产气量相对较高，且在总产气量上差别不大，分别为342 mL和365 mL；而5 d和10 d生物预处理的玉米秸秆的累积产气量较低，总产气量分别为286 mL和306 mL。这说明在20 d的预处理时间内，预处理时间越长，越有利于提高玉米秸秆的产气率。

2.6 产气率和平均甲烷含量

未处理和不同生物预处理时间的玉米秸秆的生物气产气率如图6所示。

图6 未预处理与不同生物预处理时间的玉米秸秆的生物气产气率Fig.6 Biogas production rate of corn straw untreated and different biological pretreatment times

由图6可以看出，复合菌剂预处理的玉米秸秆的产气能力比未处理的玉米秸秆均有提高，其中15 d和20 d预处理时间的产气率达到了342 mLN/gTS和365 mLN/gTS，分别提高了33.07%和42.02%。

实验结果表明，复合菌系预处理能大幅提高玉米秸秆的生物气产量。

为了比较能源转化率和生物降解能力，未处理和不同生物预处理时间的玉米秸秆的甲烷产气率如图7所示。

图7 未预处理与不同预处理时间的玉米秸秆的甲烷产气率Fig.7 Methane production rate of corn straw untreated and different biological pretreatment time

由图7可以看出，5、10、15、20 d生物预处理的玉米秸秆的甲烷产率在（131～239）mLNCH4/gTS范围内，比未预处理的玉米秸秆的甲烷产率提高了26.70%～75.57%。这个结果更加证明了生物预处理能有效地增加玉米秸秆的生物降解能力和生物能产率。

本研究的生物预处理后的甲烷产气率比先前的报道要高，这主要是由于微生物预处理提高了其产气率。

沼气中所含能量不仅取决于沼气的体积，还和其中的有效成分甲烷有关。未预处理和不同生物预处理时间的玉米秸秆所产生物气中有效成分甲烷的平均含量见表2。

表2 未预处理和不同生物预处理时间的玉米秸秆所产生物气中平均甲烷含量Table 2 Average methane content in biogas produced by corn strawuntreated and different biological pretreatment times

由表2可以看出，复合菌剂预处理不仅能提高玉米秸秆所产生物气体积，还能提高其中甲烷的含量，即提高其品质。

3 结 论

在本研究中，对复合菌剂预处理玉米秸秆的重要影响因素进行了深入分析，对秸秆表面微观物理结构变化进行了SEM扫描观察，化学结构变化进行了XRD分析，化学成分变化进行了半纤维素、纤维素、木质素含量和每日产气量，累积产气量及甲烷产气率等的测定，主要结果如下：

（1）通过SEM观察发现，经复合菌剂预处理后的玉米秸秆的表面物理结构变得疏松和凹凸不平，出现了明显的分层脱落和很多水解破洞，且去纤维化随着预处理时间的延长而加剧。被木质素紧裹的纤维素和半纤维素裸露出来，使得其更易被厌氧消化细菌接触到并消化利用。

（2）通过XRD分析发现，经复合菌剂预处理后的玉米秸秆中纤维素的化学结构变化显著，部分纤维素和半纤维素中的重要连接键被破坏，从而被降解成了易消化利用的小分子物质。此外，木质素和纤维素、半纤维素之间的酯键发生断裂，从而使木质纤维素的网联结构遭到破坏。

（3）通过纤维素、半纤维素和木质素含量分析发现，经复合菌剂预处理后的玉米秸秆的纤维素、半纤维素和木质素含量有了明显的降低，并且预处理时间越长，纤维素、半纤维素和木质素的含量下降越多。

（4）经复合菌剂预处理样品的产气性能出现了明显的加强，可厌氧消化的有效成分增多，从而在相同的秸秆量下有更多的生物气产量，即单位玉米秸秆的产气量得到了明显提高。

（5）复合菌剂预处理不仅能够提高玉米秸秆所产生物气的体积，还能提高其中甲烷的含量，即提高其品质。经复合菌剂预处理的玉米秸秆的甲烷产率相对于未预处理的玉米秸秆的甲烷产率有明显提高，由此证明了复合菌剂预处理能有效地提高玉米秸秆可生物降解性和甲烷产率。