HPLC-MS/MS法同时测定人血浆中利培酮和帕利哌酮的浓度

何秀玲，谭金华，宋天云，唐霞，夏小容，温预关（.暨南大学附属江门中医院Ⅰ期临床研究中心，广东 江门 529000；2.广州医科大学附属脑科医院药学部，广州 50370）

利培酮（risperidone）作为精神分裂症的一线治疗药物，具有较强的中枢5-羟色胺（5-HT）和多巴胺（D2）受体拮抗作用，口服吸收快，椎体外系不良反应发生率较低[1]，被临床广泛使用。帕利哌酮是利培酮经细胞色素P450（CYP）同工酶代谢后的活性产物，有研究表明CYP2D6是利培酮最主要的代谢酶，其代谢表型分为超强代谢型、强代谢型和弱代谢型，利培酮在不同的代谢表型人群中的药动学参数有差异[2-3]。德国神经精神药理学与精神病药理学会推荐在使用利培酮、帕利哌酮等药物治疗时进行药物浓度监测[4]，制订个体化给药方案，以期提高药物治疗疗效和安全性。目前国内采用HPLC-MS/MS法测定人血浆中利培酮和帕利哌酮的报道较少，现有的研究方法存在样品前处理复杂、分析时间较长、基质效应明显、定量限过高等不足[5-6]。为此，本研究在已有文献[7-9]的基础上，采用稳定同位素作为内标，建立同时测定人血浆中利培酮和帕利哌酮的方法，并进行方法学验证。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-30AD高效液相色谱联用质谱仪Triple Quad TM 5500（日本岛津公司）和Applied Biosystems/（Sciex公司）；XW-80A型旋涡混合器（原上海医科大学仪器厂）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；BP110S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；LC-456R型低速冷冻离心机（安徽中佳科学仪器有限公司）；100～1000 μL手动移液器（Thermo公司）。

1.2 试药

利培酮对照品（批号：20180918，纯度：99.9%，中国食品药品检定研究院）；帕利哌酮对照品（批号：20181015，纯度：99.6%，USP）；内标：利培酮-d4（批号：20190220）、帕利哌酮-d4（批号：20190324）（TPC公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merk公司）；甲酸（色谱纯，Adamas公司）；醋酸铵、英脱利匹特-20%（Sigma公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Atlantis T3（2.1 mm×50.0 mm，5.0 µm），预柱型号：Security Guard Cartridges C18（4 mm×2.0 mm，Phenomenex）；流动相A为含0.1%甲醇和5.00 mmol·L－1醋酸铵的水溶液，B为含0.1%甲醇的乙腈，梯度洗脱（0～3 min，22%B，3.0～3.1 min，22%～90%B；3.1～3.6 min，90%B；3.6～3.7 min，90%～22%B；3.7～5.0 min，22%B）；流速为 0.4 mL·min－1。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），喷雾电压（IS）为4000 V，涡旋离子喷雾温度为550℃，气帘气（Cur）为35 psi（1 psi＝6.895 kPa），雾化气（Gas1）为50 psi，辅助加热气（Gas2）为50 psi，碰撞气（CAD）为9 Unit，正离子多离子反应检测（MRM）。利培酮和帕利哌酮的定量离子对分别为m/z411.2→191.1和m/z427.0→207.0，去簇电压（DP）分别为95 V、100 V，入口电压（EP）均为10 V，碰撞能（CE）分别为39 V、35 V，内标利培酮-d4定量离子对为m/z415.2→195.1，帕利哌酮-d4定量离子对为m/z431.2→211.1。其二级质谱子离子扫描见图1。

图1 利培酮（A）、帕利哌酮（B）、利培酮-d4（C）和帕利哌酮-d4（D）的二级质谱子离子扫描图Fig 1 Secondary mass spectrum product ion scan of risperidone（A），paliperidone（B），risperidone-d4（C）and paliperidone-d4（D）

2.3 对照品溶液和内标溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 用甲醇溶解利培酮和帕利哌酮对照品，得到0.500 mg·mL－1的对照品储备液。储备液存于透明玻璃瓶，在－20℃条件下长期保存。

2.3.2 内标溶液的制备 用甲醇溶解利培酮-d4对照品（2.5 mg/支）和帕利哌酮-d4对照品（1 mg/支），得到2.00 mg·mL－1的利培酮-d4储备液和1.00 mg·mL－1的帕利哌酮-d4储备液。储备液存于透明玻璃瓶，在－20℃条件下长期保存。

2.4 血浆样品处理

取50.0 μL的血浆样品加入预先加了内标工作溶液50.0 µL的96孔板，将96孔板振摇约1 min，再加入200 µL的甲醇，振摇约10 min，室温条件下4000 r·min－1离心10 min，取100 µL上清液转移至干净的96孔板中，用200 μL超纯水稀释，将96孔板充分振摇10 min后置于自动进样器进行HPLC-MS/MS分析。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性 取来自不同健康者的空白血浆6份，其中3份加入0.500 mg·mL－1的储备液和内标溶液，其中3份不做处理，除不加内标按“2.4”项下方法处理，进行分析，得色谱图2A、B；取服用利培酮剂量2 mg患者的血浆样品，按“2.4”项下方法处理，进行分析，得色谱图2C。利培酮和利培酮-d4的保留时间约为1.9 min，帕利哌酮和帕利哌酮-d4的保留时间约为1.4 min。在分析物和内标相应保留时间的地方，无干扰峰出现。血浆中无内源性物质干扰测定，专属性强。

2.5.2 标准曲线及定量限 将“2.3”项下配制好的溶液分别加入到空白血浆中制备成质量浓度为利培酮0.0500（LLOQ）、0.100、0.500、1.00、3.00、5.00、15.0、30.0 ng·mL－1；帕利哌酮0.0500（LLOQ）、0.100、0.500、1.00、3.00、5.00、10.0、15.0 ng·mL－1的溶液。按照“2.4”项下方法处理后进样，以分析物质量浓度为横坐标，分析物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W＝1/χ2）最小二乘法进行回归运算，得利培酮回归方程：y＝0.9121x＋0.001 274（r＝0.9985），定量限为0.05 ng·mL－1，在0.05～30 ng·mL－1与峰面积线性关系良好；帕利哌酮回归方程：y＝0.9495x＋0.015 92（r＝0.9983），定量限为0.05 ng·mL－1，在0.05～15 ng·mL－1与峰面积线性关系良好。

2.5.3 回收率及精密度试验 将定量限、低、中和高质量浓度质控工作溶液各6份分别与空白血浆涡旋混匀，按“2.4”项下方法处理后进样，连续测定3批，计算批内、批间的准确度与精密度。同法以空白血浆、除不加标准系列溶液和内标外，按“2.4”项下方法处理后，再加入相应质量浓度的利培酮和帕利哌酮，以0.2 mL流动相溶解，离心后取2 μL进样，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率，结果见表1。

2.5.4 基质效应 收集6个不同来源的空白人血浆，各取0.1 mL空白血浆，加入低、中、高质量浓度的工作液5 μL和内标20 μL，混匀，每个浓度平行制备3份。通过计算基质存在下的峰面积（由空白人血浆提取后加入待测物和内标测得），与不含基质的相应峰面积（待测物和内标的纯溶液）比值，计算每一待测物和内标的基质因子。进一步通过待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。结果利培酮低、中、高3个质量浓度水平的内标归一化因子的RSD在1.7%～4.5%，帕利哌酮在2.0%～5.2%，基质效应对浓度测定的干扰极小，可忽略不计。

2.5.5 溶血效应和高脂效应 将2%的冷冻后全血加入空白基质中得到溶血基质，将一定比例的脂肪乳（脂含量为20 mg·mL－1）加入空白基质中得到高脂基质，用溶血血浆和高脂血浆分别配制低、中、高质量浓度的质控样品（每个浓度水平3个重复），处理后进样分析。结果利培酮溶血质控样品平均测定值与其理论值的偏差在1.12%～4.44%，帕利哌酮在2.52%～4.81%，认为在质量浓度测定时溶血和高脂的影响可以忽略不计。

2.5.6 稳定性试验 分别制备低、中、高3种质量浓度利培酮和帕里哌酮血浆样品，考察分别经过室温放置16 h、－70℃冻融5次和－70℃冻存61 d处理后血浆样品的稳定性。得到利培酮和帕里哌酮血浆样品的准确度均在±15%，稳定性符合相关要求，结果见表2。

表2 血浆中帕利哌酮和利培酮的稳定性(n＝6)Tab 2 Stability of paliperidone and risperidone in the plasma (n＝6)

2.6 质控药品的监控

按“2.5.2”项下方法分别配制低、中、高3种质量浓度血浆样品，置－20℃冻存，备用，作为质控样品。制作随行标准曲线及检测低、中、高3种质量浓度双份质控样品，如果相对回收率均在85%～115%（低浓度可在80%～120%），即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。本文的结果符合相关要求。

2.7 药动学应用

6名健康受试者，男女各半，体质量（54.33±7.76）kg，年龄（30.33±7.06）岁，身高（168.08±7.09）cm。试验采用2周期的二重2×2拉丁方自身对照试验设计，6例受试者口服剂量均为2 mg，清洗期14 d。受试者于前一晚开始禁食至少10 h，给药前抽取空白血样4 mL，单次给药用200 mL温水送服，给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h分别采集静脉血4 mL，装入肝素钠试管，3000 r·min－1离心10 min后，分离血浆，置－70℃储藏备用，测定后计算得主要药动学参数见表3。

表3 6名健康受试者口服利培酮2 mg后的主要药动学参数(±s)Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of 6 healthy subjects after the oral administration of 2 mg risperidone (±s)

表3 6名健康受试者口服利培酮2 mg后的主要药动学参数(±s)Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of 6 healthy subjects after the oral administration of 2 mg risperidone (±s)

药动学参数利培酮帕利哌酮Cmax /（ng·mL－1）15.74±7.1111.80±3.55 tmax / h 1.1±0.4 4.5±3.2 t1/2 / h 3.67±1.5620.54±2.65 AUC（0～48）/（h·ng·mL－1） 79.56±46.23311.22±78.96 AUC（0～∞）/（h·ng·mL－1） 80.66±60.36325.55±86.23

3 讨论

本研究曾选用ESI-MS，参照文献[2]采用甲醇直接沉淀蛋白的方法处理血样，但是方法学考察发现存在一定的基质效应。基质效应主要是由血浆内源性极性物质引起，在高比例有机相等度洗脱时，内源性物质和药物出峰时间较近，基质效应较为明显[10]。而在梯度洗脱方法研究中，首先采用较低比例的有机相冲洗，让极性物质先流出色谱柱，保证了极性物质和药物先后流出，大大降低了基质效应。此外梯度洗脱缩短了分析时间，同时压缩了色谱峰，使得色谱峰尖锐，提高了检测灵敏度。基质效应的消除方法中，使用稳定同位素内标是一个快速而有效的办法[7-9]。本研究选用稳定同位素标记内标，内标同位素纯度均在99%以上，选择合适的内标浓度，可对整个分析环节带来的误差进行有效控制，结果表明内标与分析物直接的交叉信号响应值低。与已有文献相比[1-3]，本研究增加了对高脂效应和溶血效应的考察，结果两者均不影响浓度的测定，消除了药物临床试验中高脂餐和溶血效应对分析检测的干扰。本研究中利培酮和帕利哌酮LLOQ均为0.05 ng·mL－1，与已有文献[11]相比，方法灵敏度更高，能满足临床血药浓度检测和药动学研究。

帕利哌酮是利培酮在体内经CYP2D6和CYP3A酶转化生成的代谢物[12]。有研究表明AUC的个体[2-3]差异大与CYP2D6和ABCB1的基因多态性有关。本研究中利培酮和帕利哌酮的药动学参数AUC的标准差较大，与文献报道一致[11]，为后续研究提供依据。