石榴皮活性成分治疗痤疮作用机制的网络药理学预测及实验研究＊

魏 露，吴淑辉，张 曦，吴欣桐，刘 娟，朱明芳

(1.湖南中医药大学研究生院 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院皮肤科 长沙 410005)

痤疮是一种常见的累及毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性皮肤病，青少年发病率高达79%-95%，且发病人群有向中年扩展的趋势[1]。痤疮病因复杂，皮脂稳态失衡、炎症反应、免疫应答、激素分泌等参与痤疮的进程[2]。痤疮不仅危害皮肤健康，对患者的社交、心理健康也造成了极大的影响。抗生素类、维A酸类等为痤疮治疗的常规药物，它们在一定程度上可缓解痤疮症状，但抗生素导致耐药现象严重；维A酸有皮肤黏膜刺激和致畸性等副作用。鉴于目前痤疮治疗效果不理想、难以根治的现状，开发新型抗痤疮药物迫在眉睫。

痤疮属于中医“肺风粉刺”范畴，《内经》中载“肺者……其华在毛，其充在皮”。因此历代医家常基于“以皮治皮”理论治疗皮肤病。“以皮治皮”是根据中医象思维，在辨证论治的基础上，运用植物药材的皮部或动物的皮肤入药，治疗某些皮肤病的方法。石榴皮(Pomegranate peel)首载于《雷公炮炙论》，系石榴科植物石榴的干燥果皮，味酸、涩，性温，有小毒，归大肠经，有涩肠止泻、止血、驱虫等功效，其在皮肤病的治疗中应用广泛[3]。《医学正宗》曰“石榴皮治脚肚生疮，初起如粟，搔之渐开，黄水浸淫，痒痛溃烂，遂致绕胫而成痼疾：酸榴皮煎汤冷定，日日扫之，取愈乃止”。《得配本草》云“石榴皮，酸、涩、温……除目流冷泪，洗脚疮湿烂”。同时，其在银屑病[4]、扁平疣[5]的治疗中也有应用。现代药理研究发现，石榴皮具有抑菌[6-7]、抗炎[8]、抗氧化、调节肠道菌群[9]等药理作用，但其作用机制尚不明确。同时，石榴提取物可通过抑制痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes，C.acnes)及金黄色葡萄球菌生长、降低脂肪酶活性、抗角质细胞增殖和抗炎发挥治疗痤疮的作用[10]。课题组基于“以皮治皮”理论，利用皮类中药石榴皮治疗痤疮，疗效显著，并申请了以石榴皮为主要组成的中药面膜专利—一种中草药面膜及其制备方法(申请号：CN201510648316.6)，获得了良好的社会效益[11,12]。

如何理解中药方剂配伍形成的复杂化学体系与病证复杂生物系统的相互作用是当前中药研究面临的重要挑战。网络药理学通过将方药、病证映射于生物分子网络，建立方药与病证的关联机制，使得方剂现代研究由描述转为预测，充分发挥了方剂配伍的特色与优势，为跻身药物的前沿研究创造了有利条件[13-15]。本研究基于网络药理学方法筛选石榴皮的活性成分、作用机制，并通过动物实验验证上述预测结果，为阐明石榴皮治疗痤疮的作用靶点及机制提供参考，同时为“以皮治皮”理论在中医皮肤科的应用提供现代理论依据。

1 材料及方法

1.1 石榴皮活性成分筛选

通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、SymMap数据库(http://www.symmap.org/)筛选中药石榴皮的所有活性成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，中药类药性(DL)≥0.18[16]作为筛选条件。利用SymMap数据库获得中药的活性成分后，将OB≥30%的活性成分依次导入TCMSP数据库，若DL≥0.18则将其纳入结果。

1.2 药物作用靶点与疾病靶点预测

采用Perl软件对相关活性成分作用靶点进行预测。利用Perl软件(https://www.perl.org/get.html)和UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)查找靶点“蛋白名”对应的“基因名”，并对重复作用靶点及无对应基因名的靶点进行整合。以“acne”“acne vulgaris”和“common acne”作为关键词，通过GeneCards数据库(https://genealacart.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)获取疾病相关靶点。利用R语言软件(https://www.r-project.org/)将痤疮相关靶点与石榴皮靶点取交集，初步获得石榴皮治疗痤疮的潜在作用靶点。

1.3 药物作用靶点与痤疮疾病靶点互作网络构建及可视化

将中药与疾病的交集靶点导入String数据库(https://string-db.org/)，设置物种为人，得到潜在作用靶点之间的相互关系，导出为.tsv格式。将上述结果导入Cytoscape3.6.1软件，并利用“Network Analyzer”插件对网络的拓扑参数进行分析，以节点大小及颜色深浅反映其degree值大小。

1.4 通路富集分析

采用David生物信息学资源平台6.8(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)对上述筛选的靶点进行KEGG信号通路富集分析，限定研究物种为人，以P＜0.05为阈值，从中筛选石榴皮治疗痤疮的潜在信号通路。值得一提的是，虽然David数据库功能全面且易操作，但限于其覆盖范围及更新速度，其预测结果可能存在假阳性现象，故本研究以P＜0.05为阈值，筛选前20条通路，并结合计算机检索CNKI、WanFang和PubMed数据库，搜索痤疮发病机制相关信号通路，将两者结果进行整合，剔除无文献报道通路，增加文献报道较多的通路。所有中英文数据库检索时限均为2018年1月1日-2020年12月31日。中文检索词包括：“痤疮”“寻常痤疮”“通路”英文检索词包括“acne”“acne vulgaris”“common acne”“signaling pathway”。汇 总 检索文献的基本信息，包括：作者、年份、标题等。

1.5 “成分-靶点-通路”网络的构建及可视化

将上述所有分析结果导入Cytoscapev3.6.1软件，并通过Merge插件将“靶点-通路”网络与“成分-靶点”网络进行整合及可视化分析，构建石榴皮“成分-靶点-通路”网络。网络中的成分、靶点、信号通路采用节点(node)表示，节点之间的相互作用通过边(edge)表示。

1.6 实验动物

SPF级金黄地鼠18只，雄性，体质量(110-130)g，由中南大学实验动物学部购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0011，动物实验伦理审查编号：2019sydw0136]，实验前动物适应性饲养1周。动物实验按照中南大学实验动物学部福利和伦理原则操作。

1.7 药品与试剂

70%石榴皮多酚提取物(西安瑞盈生物科技有限公司)；自制石榴皮多酚乳膏，制作方法及步骤参考课题组的前期研究[17]。10%水合氯醛(上海山浦化工有限公司)，0.025%维A酸乳膏(商品名：迪维，规格:15g/支，国药准字：H50021817，生产厂家：重庆华邦制药有限公司)，PI3K兔多克隆抗体(美国Proteintech公司)。

1.8 动物分组及给药

将受试动物按随机数字表分为3组，即空白对照组、基质组、石榴皮多酚乳膏组[0.32g生药/(kg·天)，通过体表面积换算[18]，相当于等效剂量的2倍]，每组6只，给药方法为外用，给药部位为双侧皮脂腺斑处，2次/天，连续用药4周。

1.9 皮脂腺斑大小测量

空白组不予任何药物处理。给药前及末次给药24 h后，用剃须刀剔除金黄地鼠双侧侧腹部毛发，使皮脂腺斑充分暴露，在强光照射下，用游标卡尺测量并记录皮脂腺斑的最大横径(DT)、最大纵径(DL)，计算

DT*DL。

1.10 免疫组化检测

剪下各组金黄地鼠左侧另一半皮脂腺斑，置于-80℃环境中保存，检测皮脂腺斑组织中PI3K的表达情况，在放大20倍视野下随机挑选5个测定区域，按一定域值分割阳性细胞，测定皮脂腺斑中PI3K表达的平均积分光密度。

1.11 统计学分析

使用SPSS21.0统计软件包对数据进行处理，计量资料采用(xˉ±s)表示。用药前后比较采用配对资料的t检验，组间多重比较采用单因素方差分析，并以LSD法进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 石榴皮有效成分的筛选

在TCMSP数据库、SymMap数据库中输入“SHILIUPI”，以OB≥30%且DL≥0.18为筛选条件，共得到29种活性成分及相关信息。通过阅读相关文献，发现安石榴苷[19,20]、安石榴林[21,22]这两种化学成分虽不满足上述OB、DL筛选标准，但临床药理学实验验证有效，故亦纳入活性成分进行研究(表1)。

表1 TCMSP数据库筛选的石榴皮活性成分

2.2 中药-疾病靶点预测

利用R语言软件共收集到石榴皮活性成分靶点193个，痤疮相关靶点1371个，将疾病相关靶点与药物靶点取交集，共获得79个石榴皮治疗痤疮的潜在靶点(见图1)。

图1 中药-疾病靶点

2.3 潜在靶点互作网络的构建

潜在靶点互作网络见图2，节点越大、颜色越深，其对应的Degree值越大。结果显示该网络中的关键节点主要包括Akt1、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN、IL-1B、CXCL8、MMP9、MAPK1等，可能是石榴皮实现药理效应的核心靶点。

图2 潜在靶点互作网络

2.4 通路富集分析

通过对候选靶点进行通路富集分析，得到TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等7条信号通路。通过检索数据库，共检索到75篇文献，其中英文文献25篇，中文文献50篇，排除与David数据库检索结果重合通路后，共选用3篇文献[23-25]，得到4个痤疮发病机制相关通路，包括FoxOsignaling pathway、Ras signaling pathway、Insulin resistance、MAPK signaling pathway。将无文献报道通路剔除，添加以上4个通路映射到富集分析结果中，共得到11条主要的生物信号通路，按富集的靶标总数(n)排序如表2。

表2 通路富集分析信息

2.5 “成分-靶点-通路”网络构建及可视化

利用Cytoscape v3.6.1软件绘制“活性成分-靶点-通路”网络(图3)。在网络中，节点的度值代表和此节点相连接的边的条数，根据网络拓扑学原理筛选度值较大的化合物节点进行分析，度值排名前3的药物成分为槲皮素(132)、木犀草素(49)、山奈酚(48)，其可能是石榴皮治疗痤疮关键活性成分。由图3可见，PTGS2、PTGS1、KCNH2、AR、Akt1、MAPK1等靶点与药效成分互作次数显著高于其他节点，提示以上靶点在网络中较重要，这与潜在靶点互作网络的结果相符；根据通路富集分析结果的P值大小，可知PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、FoxO信号通路等成为有效信号通路的可能性和准确性较高。

图3 石榴皮“成分-靶点-通路”网络

2.6 皮脂腺斑面积比较

给药前，3组皮脂腺斑大小经方差检验，差异无统计学意义，具有可比性。给药后，各组皮脂腺斑大小较给药前均有增大，考虑与饲养致体表面积增大有关。给药后，与空白组、基质组相比，石榴皮多酚乳膏组同侧皮脂腺斑面积明显缩小，差异有统计学意义(P＜0.05)(表3)。

表3 治疗前后各组金黄地鼠双侧皮脂腺斑面积的比较(±s；n=6)

表3 治疗前后各组金黄地鼠双侧皮脂腺斑面积的比较(±s；n=6)

注：与空白组比较，*P＜0.05；与基质组比较，#P＜0.05。

组别空白组基质组石榴皮多酚乳膏组给药前左侧/mm2 35.67±3.87 35.34±2.72 36.20±2.43右侧/mm2 36.94±3.11 37.03±2.64 37.87±2.98给药后左侧/mm2 48.05±2.62 46.20±4.88 41.43±3.39*#右侧/mm2 48.34±3.68 47.88±5.45 41.40±4.43*#

2.7 各组金黄地鼠皮脂腺斑PI3K蛋白的表达

免疫组化显示，PI3K主要分布在皮脂腺细胞的细胞浆上(图6)。与空白组相比，基质组皮脂腺斑PI3K表达无统计学意义(P＞0.05)；与空白组相比，石榴皮多酚乳膏组皮脂腺斑PI3K表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与基质组相比，石榴皮多酚乳膏组皮脂腺斑PI3K表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上表明，石榴皮多酚乳膏可使金黄地鼠皮脂腺斑PI3K的表达降低(表4)。

表4 各组金黄地鼠皮脂腺斑PI3K表达情况的平均积分光密度值比较(±s；n=6)

表4 各组金黄地鼠皮脂腺斑PI3K表达情况的平均积分光密度值比较(±s；n=6)

注：与空白组比较，*P＜0.05；与基质组比较，#P＜0.05。

组别空白组基质组石榴皮多酚乳膏组PI3K 0.42±0.03 0.41±0.03 0.37±0.03*#

3 讨论

3.1 石榴皮防治痤疮的理论渊源

中医认为痤疮是由于外受风邪，肺经蕴热、湿热蕴结，痰湿互结、毒热互结，肝肾阴虚、冲任失调而发病[26]。根据“整体观念”和“取类比象”思维，中医学认为人体皮肤的病变是相应脏腑或局部皮肤病变的结果。皮类药物取自于动植物器官表皮，与人体皮肤一样为身体之藩篱、卫外之屏障[27]。《中药图谱》和《食物本草》中记载：石榴皮水煎液可用于治疗各种皮肤疥癣。《玉楸药解》云“石榴皮酸涩收敛，治下利遗精、脱肛便血、崩中带下之病，点眼止泪，涂疮拔毒”。石榴皮提取物中多酚总量与其多种生物活性呈明显的正相关[28]。顾政一等[29]研究表明，石榴皮多酚可促进大鼠急性皮肤创伤部位伤口愈合。课题组前期研究表明，石榴皮多酚对兔耳粉刺模型具有抗角化、抗炎的作用[30]。同时，Boo YC等[31]认为石榴或石榴皮中的酚类具有抗氧化、抗炎的作用，对寻常痤疮、特应性皮炎等皮肤病均有改善作用。

图4 PI3K在皮脂腺斑组织中的分布

3.2 关键成分分析

本研究对获取的31种具有相关生物活性的化学成分进行分析，其中有较多作用靶点的成分主要有槲皮素、山奈酚、木犀草素，其可能是石榴皮发挥治疗作用的重要成分。槲皮素具有抗氧化、调节脂质代谢、心血管保护等药理作用。痤疮发病与人皮脂腺细胞的脂质分泌、代谢紊乱密切相关。而在人原始脂肪细胞中，槲皮素具有抗炎、改善胰岛素抵抗的作用[32]。山奈酚具有良好的抗炎、抗癌、改善胰岛素抵抗等作用，抑制肿瘤生长形成等药理活性。研究表明，槲皮素、山奈酚通过抑制痤疮丙酸杆菌生长，增强红霉素的抗炎作用，从而发挥治疗痤疮的作用[33]。而以木犀草素为主要成分的疤痘霜具有活血清热解毒的作用，适用于各类寻常痤疮[34]。由此可见石榴皮防治痤疮的活性成分主要通过抗炎、调节脂质代谢、改善胰岛素抵抗发挥作用。

3.2 关键靶点分析

石榴皮的31种活性成分共涉及193个靶点。潜在靶点互作网络结果显示石榴皮可能通过Akt1、IL-6、VEGFA、PTGS2等靶点实现药理效应。研究表明白藜芦醇主要通过抑制Akt表达，降低皮脂生成，从而治疗痤疮[35]。IL-6基因启动子多态性可能与痤疮的易感性有关，但与痤疮患者的严重程度无关[36]。一项临床研究表明，异维甲酸可显著升高痤疮患者血清sVEGFR3水平，并降低血清sVEGFR1水平，而对血清sVEGFR2水平无明显影响[37]。PTGS2又名环氧合酶-2(Cyclo-oxygenase 2，COX-2)，其通过调节皮脂腺细胞增殖、脂质合成，及毛囊皮脂腺单位炎症反应参与痤疮的发生[38]。石榴皮活性成分通过调节这些靶点起到防治痤疮的作用。

3.3 关键通路分析

通过KEGG通路富集分析及文献检索，初步获得石榴皮治疗痤疮的11条潜在通路：PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、FoxO信号通路等。Mastrofrancesco A等[39]的研究表明，激活PI3KAkt信号通路可诱导SZ95人皮脂细胞脂质合成，促进细胞生长、增值，导致痤疮加重。Mirdamadi Y等[40]发现IGF-1和胰岛素在作用于初始T细胞15 min后，能够促进其细胞质p-Akt的表达，且将SZ95人皮脂腺细胞与T细胞共培养后p-Akt表达上调，因此猜测IGF-1和胰岛素刺激后的SZ95能够分泌某些因子，减少T细胞增殖，诱导p-Akt的表达，最终导致痤疮发生。一项荟萃分析显示，TNF-α基因的多态性与不同人种的痤疮易感性相关[41]。Choi JJ等[42]的研究表明，TNF-α通过作用于PI3K-Akt信号通路促使SZ95细胞脂质合成。Agak GW等[43]的研究表明，与健康皮肤相比，痤疮患者皮肤表面C.acnes可以诱导产生不同表型的Th17细胞。Shi G等[44]发现IGF-1可能通过PI3K-Akt-FoxO1信号通路抑制角质形成细胞分化，而异维甲酸对痤疮的治疗作用可能与增强FoxO1表达有关。文献证明这些信号通路大都涉及皮脂分泌、炎症反应、氧化应激、免疫应答等环节，它们参与了痤疮基本病理生理过程。

本研究使用的TCMSP数据库虽存在局限性，如无法提供药物体内外成分的变化，但其整合了药物化学、药代动力学、网络靶点预测等信息，构建的中药化学分子库较为全面，提供了ADME参数、成分作用靶点等关键信息，准确性和查全性可靠，是目前中药网络药理学领域较为公认的数据库[45]。口服和经皮给药药物的生物利用度不同，但现有网络药理学数据库无经皮吸收药物的生物利用度指标，这在一定程度上增加了进行相关药物网络药理学研究的难度。鉴于外治法在中医外科学应用的广泛性，有必要在现有数据库中增加经皮吸收药物的生物利用度评价指标。

结合痤疮的文献研究[42,46]：PI3K信号通路参与痤疮皮脂稳态失衡的发生与发展，课题组重点研究了PI3K蛋白在金黄地鼠皮脂腺斑中的表达情况。为了验证网络药理的部分预测，本研究进一步研究了石榴皮多酚对金黄地鼠皮脂腺斑增生、皮脂腺斑组织PI3K表达水平的影响。结果表明：石榴皮多酚乳膏能使金黄地鼠皮脂腺斑面积缩小，降低皮脂腺斑组织中PI3K蛋白的表达，此结果与网络药理学的预测结果一致。

综上所述，石榴皮治疗痤疮的活性成分可能是槲皮素、山奈酚、木犀草素等，上述活性成分主要作用于Akt1、IL-6、VEGFA、PTSG2等靶标基因，参与调节PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、FoxO信号通路等调控皮脂稳态、抑制炎症反应等，从而发挥治疗痤疮的作用。本研究从理论预测、整体分析角度，初步揭示了石榴皮治疗痤疮的潜在活性成分及其可能的作用机制，进一步经实验证实，石榴皮多酚乳膏能够抑制金黄地鼠皮脂腺斑组织中PI3K蛋白的表达，抗皮脂腺斑增生，进而发挥治疗痤疮的作用。本研究可为实验研究石榴皮治疗痤疮的作用机制提供参考，同时为“以皮治皮”理论在中医皮肤科的应用提供现代理论依据。