活血接骨方对骨髓间充质干细胞成骨分化中Wnt信号通路及Sclerostin基因的影响＊

俞云飞，王建伟，冯 骅，尹 恒，华 臻，吴 毛

(无锡市中医医院骨科 无锡 214000)

1 引文

骨折作为以骨小梁损伤断裂为病理特征的临床疾病，骨折愈合是指骨折处连续性组织修复，而骨组织的修复重建涉及多种组织和细胞参与，其中干细胞来源的骨组织重建是骨折修复的重要组成部分，骨髓则是干细胞的主要来源。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)也称骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell，MSC)是骨髓内存在的一类非造血干细胞，当机体发生骨折时，在局部微环境的诱导刺激下，向骨折处聚集、迁移，诱导并分化成为成骨细胞参与骨组织修复与重建。现代研究表明[1]，BMSCs可以在多种生物信号因子及信号通路的调控下参与骨代谢过程。骨形态发生蛋白(BMP)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，包括BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9等具有骨诱导活性的生物因子，被证实可以通过Smad、Wnt等骨代谢相关信号通路参与调控BMSCs介导的骨修复过程[2]。

Sclerostin也称骨硬化蛋白/硬骨素，作为骨细胞和软骨细胞特异性表达的分泌性蛋白，早期研究中被当做BMP抑制剂，通过调节Smad信号通路参与骨代谢形成过程。近期研究表明[3]，Sclerostin主要通过阻碍Wnt信号通路激活，而非既往认为的抑制Smad通路调控骨代谢过程。国外有学者发现[4]，Sclerostin基因敲除小鼠中骨量明显增加，而过表达小鼠出现骨量减少、成骨细胞数量减少等趋势。在对BMSCs细胞的相关研究中发现[5]，Sclerostin不仅可以抑制BMSCs的成骨分化过程，还可以减弱BMSCs细胞增殖活性及钙化作用，对骨形成起负性调控作用。目前已证实，经典Wnt信号通路是调节BMSCs成骨分化的重要途径，该途径的激活可促进成骨细胞分化与细胞矿化现象发生。

“刘氏骨伤”作为无锡市非物质文化遗产，主张以中医手法为主、内服外敷为辅，要求内外兼治、动静结合[6]。多年来经多代传人总结、完善形成的我科经验方—活血接骨方，临床验证具有良好的治疗效果[7-9]，但其中的作用机制仍不十分明确。祖国医学一般将其归属到“骨折病”范畴，并且与瘀血关系密切[10]。有研究表明[11,12]，活血接骨类中药汤剂可以通过拮抗环氧化酶2(COX-2)抑制剂，促进上调BMP-2及骨钙素(OC)基因表达并增强成骨细胞活性，从而参与并促进骨折早期愈合过程。“续骨活血汤”作为中医传承经验方，主要功效活血祛瘀，止痛续骨，在治疗促进骨折愈合取得良好的临床疗效。我们前期研究发现，通过siRNA抑制Sclerostin基因可以促进BMSCs体外成骨分化过程[13]。在此基础上，本研究依托无锡市科教强卫项目(编号：ZDRC025)，以BMSCs为研究对象，设计完整实验，探究在成骨诱导条件下，活血接骨方对BMSCs体外成骨分化过程中Sclerostin基因及Wnt信号通路的影响，揭示活血接骨方促进骨折愈合的可能作用机制。

2 材料与方法

主要试剂和仪器：DMEM(Hyclone，美国)；胎牛血清(GlBICO，美国)；胰蛋白酶(Sigma，美国)；CCK-8试剂盒(Abcam，美国)、茜素红(Sigma，美国)；总蛋白提取试剂盒(上海碧云天公司，中国)；一抗：Col1A2(货号ab96723，稀释比例1∶500)、OC(货号ab13420，稀释比例1∶500)、OPN(货号ab8448，稀释比例1∶1000)、Sclerostin(货号ab63097，稀释比例1∶1000)、Wnt5a(货号ab72583，稀释比例1∶1000)、GSK-3β(货号ab227208，稀释比例1∶500)、P-GSK-3β(货号ab75745，稀释比例1∶500)及GAPDH(货号ab9485，稀释比例1∶2500)均为美国Abcam公司产品。二抗：山羊抗兔抗体(货号7074，稀释比例1∶2500)和马抗小鼠抗体(货号7076，稀释比例1∶2500)为美国CST公司产品；NanoDrop 2000(Thermo＆Scintific，美国)；细胞计数仪和Trizol(Invitrogen，美国)；实时PCR试剂盒(TOYOBO，中国)；实时PCR仪(RocheLightCycler480，德国)；PCR反应体系和反转录试剂盒(Fermentas，美国)；SDSPAGE凝胶配制试剂盒和ECL发光液(上海碧云天公司，中国)。

2.1 活血接骨方含药血清制备

活血接骨方组成：主要成分包括地鳖虫、血竭、川芎、川断、乳香、没药、白术、丁香、杜仲、骨碎补、党参、当归、黄芪、自然铜、熟地、苏木等药物组成等。无锡市中医医院药剂室制备，使用0.9%氯化钠配置成终浓度为0.45 g·mL-1生药，再经过瓶装、封盖、灭活，置于4℃冰箱保存。取与中药汤剂相同剂量的0.9%氯化钠溶液配置成对照溶液。

活血接骨方含药血清制备：取体重为200-250 g SD大鼠10只，依据《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》计算实际大鼠灌药剂量，空白血清组给予等量生理盐水。每天于8点、20点分别灌服中药或生理盐水1次，连续7天，第7天上午8点灌注全天量，灌服后1 h后于下腹主动脉采血，经静置、离心、灭活补体、过滤除菌等步骤制得，分装并标记含中药血清和空白血清，放置于-20℃保存备用。

2.2 BMSCs分离与培养

分离：取体质量100-150 g SD大鼠，采取颈断法处死后75%乙醇浸泡消毒，剥离并折断胫骨及股骨，用含双抗PBS液(终浓度为青霉素100 U·mL-1和链霉100μg·mL-1)冲洗出骨髓细胞，离心去上清液、PBS重悬，细胞计数。

培养：按1×105个·cm-2密度将细胞均匀接种于MGM培养基，加入10%FBS、1%双抗，37℃、5%CO2环境的恒温箱中培养，3天换液1次，继续培养7天后收集细胞，取部分用于实验，部分液氮冷藏保存。

2.3 BMSCs成骨分化诱导

将BMSCs按1×105个·cm-2密度接种于6孔板中，使用含MGM培养基的成骨诱导液(100 nmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠、50 mg·L-1抗坏血酸)培养24 h后进行试验。依据干预培养条件分为4组：对照组(含10%空白大鼠血清)、中药组(10%含药大鼠血清)、BMP-4组(含0.1 ug·mL-1BMP-4)，中药+BMP-4组(10%含药大鼠血清+0.1 ug·mL-1BMP-4)，3天换液1次，共培养28天。采用CCK-8检测细胞活性；采用实时荧光PCR和Western Blot检测成骨分化相关分子(Col1A2、OC、OPN)及Sclerostin基因的mRNA和蛋白水平表达情况；采用ALP和茜素红染色检测细胞矿化程度。

2.4 中药含药血清对Wnt信号通路的浓度依赖性研究

将BMSCs按1×105个·cm-2密度接种于六孔板培养皿，依据培养血清浓度分4组：空白对照组(含10%空白大鼠血清)、低浓度组(5%含药血清)、中浓度组(10%含药血清)、高浓度组(含20%含药血清)，最终使用空白大鼠血清调配使各组最终大鼠血清终浓度为20%，3天换液1次，共培养7天。采用CCK-8检测细胞活性；采用实时荧光PCR和Western Blot检测Sclerostin基因和Wnt信号通路相关分子(Wnt5a、GSK-3β)的mRNA和蛋白水平表达情况。

2.5 主要检测技术与方法

DNA含量分析：依照CyQUANT细胞增殖检测试剂盒操作步骤(购自Invitrogen公司)进行实验，其中激发波长为450 nm，发射波长为530 nm。

CCK-8法：依照CCK-8试剂盒操作步骤(购自Abcam公司)进行实验，使用酶联免疫检测仪OD 450 nm处测量各孔的吸光值并计算。

实时荧光PCR法：收集细胞样品，抽取总RNA，以2μg反转20μL体系进行反转录。检测Sclerostin、Col1A2、OC、OPN、Wnt5a、GSK-3β的mRNA表达。将反转的cDNA稀释5倍，进行实时PCR。扩增体系为10μL，反应条件：95℃预变性30 s；95℃5 s、60℃25 s，扩增50个循环。溶解曲线分析：95℃5 s；溶解曲线为单一峰说明是特异性扩增，阴性对照为ddH2O，GAPDH为内参，每个模板做3个复孔，结果使用相对定量2-△△Ct方法分析。引物序列详见表1。

表1 实时聚合酶链反应引物序列

Western Blot法：收集细胞样品，PBS清洗2次，按100∶1加入蛋白提取缓冲液RIPA(radioimmunoprepciption assay)和蛋白酶抑制剂PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)提取蛋白，置于冰上30 min后，4°C 12000 rpm离心10 min，吸除上清，4℃备用，置于-20℃长期保存。BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，用0.22μm孔径的PVDF膜转膜，5%BSA封闭1 h，4°C一抗孵育过夜后使用0.05%TBST充分洗涤；孵育二抗，常规ECL发光液显色。

ALP染色、活性分析与茜素红染色：在成骨诱导的第28天，使用固紫B试剂盒(购自Sigma公司)以及茜素红染色法进行染色，并通过倒置显微镜观察拍照记录。使用磷酸酶分析试剂盒进行ALP定量检测(购自上海碧云天)；使用ImageJ软件对茜素红染色进行灰度检测半定量分析。

2.6 统计学处理

采用PASSStatistics 22.0统计学软件分析。数值采用(±s)表示，两独立样本采用t检验，符合正态分布且方差齐性采用方差分析，方差不齐采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 活血接骨方含药血清对BMSCs体外成骨分化及Sclerostin基因的影响

CCK-8检测结果显示：成骨诱导28天后与对照组相比(0.974±0.069)，中药组(1.239±0.108，t=2.922，P=0.043)和BMP-4组(1.386±0.043，t=7.132，P=0.002)细胞活性增强，且中药+BMP-4组(1.633±0.097，t=7.796，P=0.001)细胞活性明显增强。DNA含量检测结果也显示：相较于对照组(0.973±0.066)，中药组(1.191±0.086，t=2.821，P=0.048)、BMP-4组(1.407±0.074，t=6.156，P=0.004)和中药+BMP-4组(1.627±0.063，t=10.135，P=0.001)高于对照组(1.004±0.066)，提示含有活血接骨方的大鼠含药血清可以增强BMSCs细胞活性，且与BMP-4两者联用效果更强(图1)。

图1 各组BSMCs细胞活性比较。

ALP及定量检查结果显示：与对照组相比(0.913±0.055)，中药组(1.221±0.105，t=2.848，P=0.022)、BMP-4组(3.193±0.209，t=14.591，P=0.001)和中药+BMP-4组(4.961±0.426，t=13.105，P=0.001)BMSCs出现矿化现象、ALP活性增强。茜素红染色及半定量检测结果也显示：相较于对照组(1.007±0.102)，中药组(1.727±0.340，t=2.870，P=0.045)、BMP-4组(4.826±0.208，t=23.280，P=0.001)和中药+BMP-4组(8.627±0.620，t=17.161，P=0.001)，提示含有活血接骨方的大鼠含药血清可以增强BMSCs细胞活性，且与BMP-4两者联用效果更强(图2)。

图2 各组BSMCs细胞矿化程度的比较。

实时荧光PCR和Western Blot结果显示：①与对照组相比，中药组、BMP-4组和中药+BMP-4组BMSCs成骨相关分子(Col1A2、OC、OPN)的mRNA和蛋白水平表达明显上调(P＜0.05)；②与对照组相比，中药组Sclerostin的mRNA和蛋白水平无明显统计学差异(P＞0.05)，但BMP-4组和中药+BMP-4组Sclerostin基因的表达明显上调，且中药+BMP-4组中Sclerostin基因的表达弱于BMP-4组(P＜0.05)，提示活血接骨方含药血清可能通过抑制BMP-4介导的Sclerostin基因表达上调，促进BMSCs成骨分化过程(图3-图4)。

图3 各组BSMCs中成骨相关基因与Sclerostin基因mRNA水平表达比较

图4 各组BSMCs中成骨相关基因与Sclerostin基因蛋白表达比较

3.2 活血接骨方含药血清对BMSCs成骨分化中Wnt信号通路的影响

使用(低浓度、中浓度、高浓度)不同浓度活血接骨方含药血清干预BMSCs细胞7天并检测相关指标后发现：①各组细胞CCK-8结果(F=3.251，P=0.081)及DNA含量(F=1.499，P=0.287)无统计学差异；②相对于空白对照组，Wnt5a的mRNA和蛋白水平表达呈现浓度依赖性上调(F=3.251，P=0.081)，而Sclerostin和GSK-3β的mRNA和蛋白水平呈现与之相反下降趋势(P＜0.05)，且Tyr216位磷酸化激活的GSK-3β蛋白含量逐渐降低，表明GSK-3β的蛋白活性也逐渐降低，提示随着含药血清浓度增加，Wnt信号通路激活呈现浓度依赖性增强。(图5-图6、表2)

表2 各组BMSCs中Wnt信号通路相关分子及Sclerostin基因的mRNA表达(n=3,±s)

表2 各组BMSCs中Wnt信号通路相关分子及Sclerostin基因的mRNA表达(n=3,±s)

注：与对照组相比，a P＜0.05；与中药组相比，b P＜0.05；与BMP-4组相比，c P＜0.05。

基因Wnt5a GSK-3β Sclerostin对照组1.013±0.139 1.037±0.056 1.066±0.049低浓度组1.733±0.089a 0.835±0.084a 0.902±0.065a中浓度组2.159±0.106ab 0.691±0.058ab 0.766±0.076ab高浓度组3.101±0.334abc 0.532±0.051abc 0.593±0.044abc

图5 各组BSMC细胞活性比较。

图6 不同浓度活血接骨方含药血清对BMSCs中Wnt信号通路相关分子及Sclerostin基因的作用

4 讨论

目前骨折的治疗方法主要包括手术、药物、电磁波、射频等多种治疗方法，但各种疗效均具有自身局限性。中医药治疗骨折由来已久，祖国医学将骨折其归属到“骨折病”范畴，中医药治疗骨折病要求辨证论治、和方圆之融，强调阴阳调和，具有多靶点、多因素、多方协同治疗骨折的天然优势。目前针对中医药治疗骨折多集中于加强骨代谢形成、促进BMSCs成骨分化及原始骨组织形成等方面。BMSCs作为骨髓组织中具有多向分化能力的干细胞亚群，当机体发生骨折时，细胞会趋向性迁移、聚集于骨折断端处并促成骨分化形成骨细胞，从而形成骨痂、促进骨折愈合。目前大量文献表明，活血续骨类中药可通过促进BMP-2、BMP-4、BMP-6等成骨因子表达或增加其促成骨作用，从而实现促进骨折愈合的作用。

“刘氏骨伤”作为无锡市非物质文化遗产[6]，多年来经多代传人总结、完善形成的我科经验方-活血接骨方(又名刘氏正骨方)，临床使用疗效确切。该方主要由地鳖虫、血竭、川芎、川断、乳香、没药、白术、丁香、杜仲、骨碎补、党参、当归、黄芪、自然铜、熟地、苏木等药物组成，方中杜仲、骨碎补、自然铜、川断入肾经，补肾壮骨，续骨止痛；土鳖虫性善走窜，能活血消肿续筋，熟地补血养阴，填精益髓；党参、当归、黄芪补益气血；血竭、川芎、乳香、没药均为均有活血散瘀消肿功效，诸药合用共奏“活血祛瘀，接骨续筋”之功效。大量临床研究表明[7-9]，活血接骨方具有良好的临床疗效，但针对其促进骨折愈合的具体作用机制尚缺乏系统化、深层次的理论研究。基于上述中医理论及现代研究结果，课题组为探究活血接骨方BMSCs成骨分化的影响，开展相关研究，结果发现活血接骨方含药血清可以有效提高BMSCs细胞活性，且与BMP-4联合使用时效果更佳。ALP活性作为成骨前细胞及成骨细胞分化的早期特异性指标，与细胞增殖程度呈正相关，是细胞发生矿化及促成骨分化的基础。本研究结果中ALP染色和茜素红染色结果也证实，活血接骨方含药血清可以增强ALP活性及细胞矿化现象的发生。

骨代谢由多因素、多系统的复杂生物信息网络进行调控，其中多种因子存在相互协作又相互制约的辩证关系[14]。为探究活血接骨方与对BMSCs成骨分化的影响。课题组通过文献研究发现，Sclerostin基因作为BMP抑制物，对骨的形成代谢起负调控作用。骨源性细胞表达的Sclerostin可以通过抑制BMP因子活性降低骨源性细胞或成骨细胞的增殖，阻碍成骨分化过程，在体内受甲状旁腺、雌激素等生物因子间接或持续性的抑制影响[15,16]。我们既往研究发现[17]，在人成骨细胞中BMP-4可以呈浓度依赖性促进Sclerostin基因表达。课题组前期研究发现[13]，在BMP-4体外干预下，通过siRNA沉默Sclerostin基因可以有效促进BMSCs成骨分化及细胞矿化现象。本研究结果也再次证实BMP-4可以上调BMSCs中Sclerostin基因表达，但有趣的是，仅用含活血接骨方的大鼠血清进行28天的体外干预后，细胞中Sclerostin基因表达无明显统计学差异，但与BMP-4联合使用后可以部分抑制BMP-4介导的Sclerostin基因上调作用而增强BMP-4促成骨作用，提示含活血接骨方可能通过下调Sclerostin基因表达增强BMP-4的促成骨作用。

为了进一步探究活血接骨方的调节BMSCs成骨分化的机制途径，我们通过文献研究发现[18]，Sclerostin主要通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制成骨细胞活性。Wnt信号通路是与生长、发育以及肿瘤发生等生命过程息息相关，主要包括经典Wnt/β-catenin信号通路、非经典Wnt/Ca2+信号通路以及PCP途径，其中经典Wnt/β-catenin信号通路对骨代谢的调节具有至关重要的作用[19]。当Wnt/β-catenin处于未激活状态时，细胞质中β-catenin大部分被降解复合体磷酸化降解，从而维持一个较低的水平；而出现激活刺激信号时，BMSCs中Wnt蛋白(Wnt5a)与辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)和细胞跨膜特异性受体卷曲蛋白(Frz)相结合，通过磷酸化激活并作用于细胞质内Dsh蛋白，磷酸化的Dsh蛋白抑制糖原合成激酶(GSK-3β)活性，抑制β-catenin降解复合体活性，上调细胞质中β-catenin含量，β-catenin蛋白入核后启动下游多种成骨相关转录因子和靶基因表达，促进BMSCs成骨分化、调节骨代谢平衡[20-21]。Sclerostin作为Wnt/β-catenin信号通路的一种可溶性抑制因子，可以通过竞争性与Wnt/β-catenin信号通路中Lrp5/6中的El螺旋区域结合，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路激活、阻碍骨形成。Wnt5a作为Wnt信号通路的关键因子既参与经典Wnt信号通路，又参与非经典Wnt信号通路；不仅促进BMSCs中成骨分化，也参与成骨细胞功能的调节[22]。在此基础上，国外有学者[23]通过研究Wnt/βcatenin信号通路及BMP信号通路两者与Sclerostin之间作用后发现，Wnt5a和GIN(GSK-3β抑制剂)均增加BMP-4诱导的BMP信号，BMP-4也可以增加Wnt5a和GIN诱导的Wnt信号。然而，GIN的效果要强烈得多；随着Wnt信号通路的增加，Sclerostin表达量呈剂量依赖性下降，而在此过程中BMP-4可以诱导Sclerostin表达[24]。因此，课题组通过使用不同浓度中药血清对BMSCs进行体外干预并检测Sclerostin基因与Wnt信号通路相关因子表达情况发现，随着含药血清浓度的逐渐增高，Wnt5a表达呈现浓度依赖性逐渐增高趋势，而Sclerostin基因和GSK-3β的mRNA和蛋白表达水平则呈现逐渐下降趋势。GSK-3β是Wnt/β-catenin经典信号通路的关键因子，是一种在高度保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，可以通过不同位点磷酸化发挥不同作用，当Ser9位点磷酸化可抑制GSK-3β蛋白活性，上调细胞质内β-catenin细胞内含量，促进下游成骨基因表达；相反，当Tyr216位点磷酸化可激活GSK-3β蛋白活性，降低细胞质内β-catenin细胞内含量，抑制下游成骨基因表达。本次研究结果中，随着中药血清浓度增高，BMSCs中总GSK-3β蛋白含量逐渐降低，且Tyr216位点处的磷酸化GSK-3β蛋白也呈现降低趋势，提示活血接骨方含药血清体外诱导BMSCs成骨分化过程中，可能通过抑制Sclerosti基因表达，上调Wnt5a基因表达、下调GSK-3β基因表达及Tyr216位点的磷酸化从而促进Wnt/β-catenin经典信号通路激活，诱导BMSCs成骨分化过程。但在长期体外干预状态下，活血接骨方含药血清是否一直对WnWnt/β-catenin信号通路存在持续性影响还有待进一步探讨。

综上所述，活血接骨方含药血清可以体外促进BMSCs成骨分化，这种促成骨作用可能与BMSCs中抑制因子Sclerostin表达，激活Wnt信号通路从而促进成骨相关基因表达有关。采用现代分子生物细胞学技术，初步探讨活血接骨方治疗骨折可能的作用机制，为中医药治疗骨折提供新的思路与理论依据。

本研究局限：①本研究选用动物中药灌服法制备含药血清进行干预，受给药时机、给药方案、采血方法等因素影响，中药复方入血成分是否为药效的主要成分仍需进一步深入挖掘；②仅初步探究Wnt信号通路，针对多信号通路之间交互作用，仍需进一步研究。