新型冠状病毒肺炎患者核酸转阴时间的影响因素及与淋巴细胞亚群的关系*

刘波，单南冰，雷习群，李辉(阜阳市第二人民医院重症医学科，安徽阜阳236000)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属冠状病毒，人群对SARS-CoV-2缺乏免疫能力，具有普遍易感、传播迅速和致病能力强的特点[1]。当前，我国新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情总体相对稳定，但仍需警惕境外输入性病例以及局部地区的新发病例。病毒核酸转阴时间是评估病情进展的重要指标，也是患者解除传播风险、达到出院标准的主要参考[2]。临床经验发现，即使部分患者临床症状消失、复查胸部影像发现肺部阴影已明显吸收，但核酸检测反复阳性，而不得不继续延长治疗和隔离的时间，因此，分析可能影响核酸转阴时间的因素对于指导临床诊疗有一定意义。根据国家临床指南推荐的诊疗方案，不同临床中心、不同患者之间抗病毒药物种类的选择趋于同质化，因此多数学者认为影响病毒清除效率主要的因素仍然为机体的自身免疫能力。淋巴细胞是机体重要的免疫细胞之一，分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞等，其中T淋巴细胞在抵抗病毒感染方面发挥主要作用。本研究对COVID-19患者T淋巴细胞亚群和核酸转阴时间进行分析。

1 资料和方法

1.1临床资料 2020年2月16日—3月12日阜阳市第二人民医院累计收治COVID-19患者159例，其中包括由周边城市转入的危重型病例4例。所有患者均采集鼻咽、口咽部咽拭子，经实时荧光RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性，符合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中COVID-19诊断标准[3]。纳入标准：(1)COVID-19诊断明确；(2)临床资料齐全；(3)无院外COVID-19相关性治疗史。排除标准：(1)外市转入病例；(2)出院后随访计划中出现核酸检测复阳病例；(3)合并血液系统基础疾病，如淋巴瘤。

1.2资料收集 结合国内外研究结果和临床经验，收集可能影响核酸转阴时间的相关资料，包括：(1)人口和流行病学资料：性别、年龄、武汉旅居史、基础疾病。(2)临床症状：发热持续时间和咳嗽持续时间。(3)抗病毒和抗菌药物使用方案：药物名称，联合应用的种类。我院采取的抗病毒药物主要有洛匹那韦/利托那韦500 mg口服bid，阿比多尔0.2 g口服tid，奥司他韦75 mg口服bid；抗菌药物有第三代头孢菌素类和莫西沙星0.4 g静脉滴注qd。是否使用糖皮质激素和免疫球蛋白。(4)肺部影像学资料：采用美国GE螺旋CT扫描仪，动态复查胸部CT了解肺部炎症演变，采用半定量评分方法进行CT评分，多次CT摄片取肺部炎症最重的影像评分结果作为CT评分。根据各肺叶累及范围得分0～4分，肺叶内未见明显炎症病灶计0分，病变累计肺叶面积1%～25%计1分，累及26%～50%计2分，累及51%～75%计3分，>75%计4分，合计总分0～20分。

1.3淋巴细胞亚群和核酸转阴时间 所有患者核酸检测阳性确诊后当日采集血液样本5 mL，用迈瑞BriCyte E6型流式细胞仪(FITC、PE、PreCP以及APC步骤所需材料均来自迈瑞医疗公司)，检测T淋巴细胞计数，包括CD4+和CD8+T淋巴细胞计数。患者确诊后每间隔1 d采集咽拭子标本1次，连续2次核酸检测呈阴性视为核酸转阴，截取患者发病的日期至首次核酸检测阴性的时间，计为核酸转阴时间。

1.4临床分型 根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》将患者进行临床严重程度分型。轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现。普通型：具有发热、呼吸道等症状，影像学检查可见肺炎表现。重型：符合下列任何一条：(1)呼吸窘迫，RR≥30次/分；(2)静息状态下，指氧饱和度≤93%；(3)动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。危重型：符合以下情况之一者：(1)出现呼吸衰竭，且需要机械通气；(2)出现休克；(3)合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。重型和危重型患者统称为重症病例。

2 结果

2.1一般结果 最终纳入COVID-19患者共计155例，首例患者于1月16日入院，2月20日出院，最后1例于2月13日入院，3月12日出院，住院时间(17.29±6.20) d，范围9～35 d。102例(65.81%)为家族聚集性病例，53例(34.19%)为散发病例。临床症状表现多种多样，多数伴有2种和2种以上症状，其中以发热(92例，80.70%)和咳嗽(54例，47.37%)为主，发热患者中43例单纯表现为发热，占37.72%，持续发热时间(38.65±12.25)h，范围17～146 h；咳嗽时间(5.41±2.07)d，范围2～13 d。严重程度分级：入院时155例患者中轻型11例，普通型144例；根据分型标准，26例患者进展为重型，4例进展为危重型，重症患者占19.35%。期间每间隔1 d检测核酸，核酸转阴时间(15.88±6.36) d，范围6～38 d。经过治疗和护理，所有患者均到达出院标准，无死亡病例。

2.2影响核酸转阴时间的单因素分析 核酸转阴时间15.88 d(修约后取16 d)，分为核酸转阴时间≥16 d组(A组)和<16 d组(B组)，A组84人，B组71人。单因素分析显示，两组患者间性别、基础疾病合并率、武汉旅居史、发热持续时间、咳嗽持续时间、糖皮质激素、丙种球蛋白、抗病毒药物种类之间差异无统计学意义(P>0.05)，而年龄、临床分型、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肺CT评分之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 影响核酸转阴时间的单因素分析

2.3多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析显示，年龄≥60岁、重症患者以及CD8+T细胞水平降低是影响核酸转阴的危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响核酸转阴时间的多因素Logistic分析

2.4核酸转阴时间和淋巴细胞亚群的关系 COVID-19患者中位CD4+、CD8+T细胞计数分别为428个/μL和299个/μL；核酸转阴时间与CD8+T细胞计数呈负相关性(r=-0.689，P=0.024)，与CD4+T计数无相关性(r=-0.544，P=0.137)。

2.5CD8+T淋巴细胞预测核酸转阴时间延迟的价值 ROC曲线分析结果显示，CD8+T细胞预测核酸转阴时间延长的曲线下面积(AUC)为0.714，95%可信区间(95%CI)为0.630～0.799，最佳临界值为236个/μL，敏感性和特异性分别为80.5%和51.5%。见图1。

图1 CD8+T淋巴细胞计数预测核酸转阴延迟的ROC曲线

3 讨论

COVID-19潜伏期相对较短，早期症状往往不典型，无症状感染者也是潜在的传染源。目前，COVID-19的治疗仍缺乏特异性抗病毒药物，早隔离、早治疗是扼制病情蔓延的主要手段。核酸检测是COVID-19患者常规检查项目，也是解除隔离和出院的主要条件之一，需连续2次呼吸道标本核酸检测阴性(采样时间至少间隔1 d)，同时结合患者体温、呼吸道症状和肺部CT表现判断[4]。临床经验发现，核酸转阴时间具有明显的滞后性，部分患者临床症状消失、肺部炎症吸收，但核酸检测反复阳性，分析可能影响核酸转阴时间的因素对于预判病程、指导治疗有一定意义。

本研究中，核酸转阴时间为6～38 d，平均15.88 d，时间跨度较大，均数超出2周，与之相关的平均住院时间也达17 d以上。年龄和临床严重程度与核酸转阴时间相关，Logistics回归分析显示≥60岁的老年人群和重症患者出现核酸转阴时间延长的风险分别是非老年人群的1.72倍和2.33倍。研究证实，儿童、青少年危重症患者的比例明显较低，死亡病例的报道更是少见[5]，而老年COVID-19患者的治愈率低于中青年，治愈的老年患者平均住院时间更长、危重症的比例更高[6-7]。老年患者机体的自身免疫能力低下，基础疾病合并率高，免疫防御和清除能力不足，病毒增殖复制相对活跃。同时，SARS-CoV-2诱导机体过度免疫反应引发“细胞因子风暴”，这在重型和危重型COVID-19患者中较为常见，近期在COVID-19死亡病例的肺组织病理分析中得到进一步证实[8]。因此，危重症患者的免疫紊乱、免疫失衡不利于病毒的清除，引起病程迁延。

在2003年严重急性呼吸综合征流行期间，大量研究证明，淋巴细胞减少和T淋巴细胞亚群的持续消耗是病情进展的参考标准之一，长时间低水平CD4+、CD8+T细胞提示预后不良[9]。此次报道显示，COVID-19患者淋巴细胞水平减低亦十分常见，危重症患者细胞免疫功能受损，CD4+、CD8+T细胞水平相对更低。凌云等[10]指出，CD8+T淋巴细胞水平下降是影响病情向重症方向转化的独立危险因素。在本研究中，CD8+T淋巴细胞计数和核酸转阴时间呈负相关，多因素回归分析显示，CD8+T细胞水平降低是影响核酸转阴的危险因素。值得一提的是，各研究间对于CT分级评分的报道存在一定差异。龚惠莉等[11]纳入179例COVID-19患者进行分析指出，CT评分是影响核酸转阴的影响因素之一。在本研究中，不同核酸转阴时间的COVID-19患者CT评分差异存在统计学意义，但多因素分析CT评分并不是相关因素。除此之外，抗菌药物、抗病毒药物、糖皮质激素以及丙种球蛋白的使用对核酸转阴时间均无影响，提示上述治疗对改善症状、调节免疫有一定帮助，但不能加速机体对病毒的清除效率，COVID-19患者的恢复主要与自身免疫有关[12]。我们进一步采用ROC曲线的方法验证CD8+T细胞下降的预测价值，结果显示AUC为0.714，统计学上达到“较为准确”的标准(0.7

综上所述，COVID-19患者CD8+T淋巴细胞降低，老年人群和重症患者以及CD8+T细胞水平显著下降可能影响SARS-CoV-2核酸转阴时间，病程相对更长。