超高效液相色谱-串联质谱法测定伏立康唑血药浓度及其临床应用

欧美贤，张美微，于凡，忻亮，张梦琪，赵银霞，贾晶莹，李水军，余琛，缪怡，陆优丽

(上海市徐汇区中心医院，复旦大学附属中山医院徐汇医院，上海 200031)

伏立康唑(voriconazole，VRC)是一种三唑类抗真菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性高等特点，是深部曲霉菌感染治疗的首选，也是经验性抗真菌治疗的首选[1-2]。VRC是临床治疗侵袭性真菌感染的高效药物，对大多数真菌均有效，且不良反应较少，但临床用药具有一定局限[3-4]。VRC在体外稳定性较高[5]，但在人体内血药浓度影响因素较多，个体间血药浓度差异较大，易受其他药物、病理生理因素影响。VRC的药代动力学呈非线性特点，剂量与浓度缺乏相关性，即使给药剂量发生微小变化，也可能对药物半衰期和血药浓度产生较大影响。有研究显示，VRC的游离药物浓度(Cu)与Ct、蛋白质浓度、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平、CYP2C19代谢类型及联合应用高血浆蛋白结合率药物显著相关[6]。临床推荐对肝功能不全、联合应用影响VRC药代动力学药物、CYP2C19基因突变、发生不良事件或疗效欠佳、重症真菌感染危及生命的患者进行VRC血药浓度监测，对提高感染性疾病治愈率、减少或避免毒性反应的发生具有十分重要的临床意义[7-8]。

目前对VRC进行血药浓度监测已达成国际共识[9-10]。酶联免疫分析技术(EMIT)可用于测定VRC血药浓度，但该方法测定值高于超高效液相色谱(UPLC)法，可能与VRC代谢物干扰及联合用药有关[11]。有研究显示，在VRC血药浓度监测中，UPLC-紫外分光光度法较免疫测定法灵敏[12]。此外，也有研究使用琼脂扩散生物测定法测定VRC血药浓度，但微生物琼脂扩散法的总体线性不如UPLC[13]。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法通过直接检测目标分析物，具有灵敏度高、特异性强、准确度高等特点，可作为检测方法的金标准。然而目前报道的UPLC检测方法分析时间普遍较长，本研究拟建立灵敏度高、准确度好、分析时间较短的UPLC-MS/MS法测定VRC血药浓度，从而缩短检验结果回报时间，以满足临床及时调整患者给药方案的需求。UPLC-MS/MS法建立后可用于不同分析方法的比较，参与室间质评活动。此外，本研究利用UPLC-MS/MS法检测不同年龄中国人群VRC血药浓度水平，为后续建立针对LC-MS/MS法的VRC血药浓度参考区间提供支持。

1 材料和方法

1.1 仪器

API 4000串联质谱仪(Applied Biosystems公司)，液相系统LC-30AD(Shimadzu公司)，色谱柱Phenomenex Luna®Omega C18100A(2.1 mm×50.0 mm，1.6 μm)，预柱Waters Quality Parts ASSY FRIT(2.1 mm，0.2 μm)。Vortex-2 涡旋混合器(Scientific Industries 公司)，Mikro 22R 冷冻高速离心机(Hettich 公司)，超声波清洗器(上海必能信超声波仪器厂)，可调式移液器及连续分配移液器(Eppendorf)，离心机(5430R Eppendorf)，分析天平(CP225D Sartorius)，冰箱(HYC-360青岛海尔公司)，纯水仪(Milli-Q Advantage A10 Millipore)。

1.2 标准品与试剂

VRC(TRC公司，纯度98%)，VRC同位数(VRC-d3，TRC公司，同位素丰度99.6%)，甲酸(液相色谱纯)购自Tedia公司，乙腈(液相色谱纯)及甲醇(液相色谱纯)购自Merck KGaA公司，实验用水采用Millipore纯水系统自制。

1.3 色谱条件

采用Phenomenex Luna®Omega C18100A(2.1 mm×50 mm，1.6 μm)色谱柱，0.1%甲酸-40%乙腈水溶液等度洗脱。总运行时间1.5 min，使用了切换阀，0.8～1.3 min使流动相进质谱分析，其余时间排至废液，流速0.5 mL/min，进样量2 μL。

1.4 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式，选择MRM扫描方式，电喷雾电压5 500 V，温度550 ℃。GS1 60 psi，GS2 60 psi，气帘气30 psi，碰撞气12 psi，去簇电压(DP) 90 V，入口电压(EP) 5 V，碰撞能(CE) 24 V，碰撞室出口电压(CXP) 16 V；高纯度氮气；VRC选择母离子(Q1)/碎片离子(Q3)质荷比m/z350.2/281.4为定量通道，350.2/224.1为定性通道；VRC-d3(内标)选择母离子(Q1)/碎片离子(Q3)m/z353.3/284.2通道。

1.5 对照品及内标储备液配制

分别精密称取VRC、VRC-d3对照品适量于容量瓶中，以50%甲醇水溶液使其全部溶解后定容至刻度，混匀后转移至玻璃瓶，于-20 ℃冰箱中储存待用。

1.6 标准品和质控品配制

精密量取对照品储备液适量，用空白人血清配制成80.0、40.0、20.0、4.0、0.8及0.2 μg/mL标准血清样品和64.0、32.0及1.6 μg/mL质控样品。

1.7 血清样品预处理

取血清样品50 μL置于1.5 mL离心管中，加入10 μL内标工作液(200 μg/mL)，再加入200 μL甲醇溶液后漩涡振荡30 s，15 000 r/min离心10 min，上清液用0.1%甲酸水溶液稀释25倍混匀后进样2 μL分析。记录色谱图中分析物和内标的峰面积，以内标法进行定量。

1.8 临床样品收集

VRC开始治疗后4～7 d进行血药浓度监测，在下一次给药前抽取静脉血2 mL，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，采用UPLC-MS/MS法检测药物浓度。本研究对159例患者VRC血药浓度检测结果进行回顾性分析，部分样本为复旦大学附属中心医院重症监护室(ICU)患者外送样本，部分样本为上海市儿童医学中心ICU患者外送样本，本研究获得了上海市徐汇区中心医院医学伦理委员会批准[(2021)科审第(051)号]。159例患者中，儿童69例，成人90例；男99例，女60例。

2 结果

2.1 干扰及灵敏度考察

将空白血清样本、最低定量限(0.2 μg/mL)样本、临床样本(2.21 μg/mL)按“1.7”项下方法对样本进行前处理后进样分析。VRC(m/z350.2/281.4)空白血清样本、最低定量限及临床样本的典型色谱图，VRC-d3(m/z353.3/284.2)的典型色谱图见图1。从图1可知本方法无明显干扰，灵敏度较好。

A.空白血清样本VRC色谱图

2.2 线性关系考察

在空白人血清中加入按“1.6”项下方法制成的80.0、40.0、20.0、4.0、0.8及0.2 μg/mL血清标准样品，按“1.7”项下方法对样本进行前处理后进样分析。以待测物与内标峰面积比值(y)对浓度(x)作线性回归分析，回归方程为y=0.443x+0.019 8(r=0.999 7)。结果表明VRC在0.2～80.0 μg/mL质量浓度范围内与待测物与内标峰面积比值的线性关系良好。

2.3 准确度和精密度

按“1.6”项下方法配制成最低定量限(0.2 μg/mL)、低浓度(1.6 μg/mL)、中浓度(32.0 μg/mL)、高浓度(64.0 μg/mL)的质控样品(n=6)，分别在1天内和多天内制作3批，按“1.7”项下方法对样本进行前处理后进样分析，计算平均准确度和批内、批间精密度，见表1。各浓度平均准确度为103.5%～107.3%，批内和批间RSD均<10%，表明该方法准确度高，精密度较好。

表1 准确度和批内和批间精密度

2.4 提取回收率和基质效应

用空白血清制备低浓度(1.6 μg/mL)、中浓度(32.0 μg/mL)、高浓度(64.0 μg/mL)3个浓度的质控样品，每个浓度包括6份平行样品，按“1.7”项下方法对样本进行前处理后进样分析；另制备18份经样品预处理的空白基质，添加低、中、高3个浓度质控品，使其浓度与低、中、高3个浓度质控样品预处理后一致；提取回收率通过比较直接提取后与空白血清提取后加入的分析物或内标物的峰面积比值进行计算。取6份不同来源的空白血清基质，通过计算由空白血清基质提取后加入低浓度(1.6 μg/mL)、中浓度(32.0 μg/mL)及高浓度(64.0 μg/mL)VRC测得的峰面积，与不含血清基质相应浓度测得的峰面积比值，获得分析物或内标物的基质效应因子。VRC和VRC-d3的提取回收率和基质效应结果见表2。低、中、高3个浓度VRC提取回收率为95.20%～98.27%，VRC-d3提取回收率为97.12%～99.73%；低、中、高3个浓度的VRC基质因子效应为0.97～1.00，VRC-d3的基质因子为0.98～1.01；RSD均<10%。

表2 VRC和VRC-d3的提取回收率和基质效应

2.5 残留分析

为考察样品在进样过程中的残留情况，标准曲线最高浓度点进样后跟随一个空白血清样品，空白血清样品的分析物平均峰面积不大于该批次最低定量限分析物平均峰面积的20%。考察的空白血清样品的内标平均峰面积在该批次最低定量限内标平均峰面积的5%以内。考察批次分析物及内标的残留符合要求。

2.6 室间质评

参与美国病理学家协会(CAP)2019年上半年(样本编号AFD-01～AFD-03)及2019年下半年(样本编号AFD-04～AFD-06)的室间质评活动。本研究检测结果与均值的偏差为-7.74%～-0.85%，见表3。

表3 LC-MS/MS法VRC两次CAP室间质评结果 μg/mL

2.7 临床样品检测结果

159例患者VRC血药浓度检测结果显示48.5%的VRC血药浓度不在治疗范围内。此外，对159例样本按年龄分为0～2岁、3～13岁、30～50岁、51～65岁、66～89岁5个年龄段组，对其VRC血药浓度作小提琴图，见图2。0～2岁组VRC血药浓度中位数低于有效浓度下限，但部分样本达到了严重中毒浓度；3～13岁组检测结果分布广泛，个体差异较大；30～50岁组为浓度最集中的一个组；51～65岁及66～89岁组较其他组浓度更为集中，但部分样本低于有效浓度，也有部分样本达到了严重中毒浓度。

图2 不同年龄段人群VRC血药浓度小提琴分布图

3 讨论

侵袭性曲霉菌病(IA)是免疫功能低下患者最常见的危及生命的并发症之一，VRC是目前治疗IA的首选药物。然而，一些IA患者免疫功能低下，如治疗不及时常常危及生命，为避免病情恶化需通过治疗药物监测调整VRC剂量[14-15]。UPLC-MS/MS法具有样品前处理简便快捷、色谱时间短、线性范围广等优势，适用于实验室高通量样本检测的需求，尤其适用于准确度要求高、分析时间短的血药浓度监测[16]。有研究显示，VRC和IS色谱保留时间分别为6.4 min和5.6 min[17]。另一项高效液相色谱(HPLC)法检测VRC血药浓度的研究中，VRC保留时间为4.5 min[18]，分析时间均较长，不利于缩短检验结果回报时间。本研究所建立的定量检测VRC方法样本前处理简便，为蛋白直接沉淀；VRC保留时间为1.0 min，单个样本液相及质谱总运行时间为1.5 min，可用于临床VRC的血药浓度快速监测和报告。本研究采用VRC同位素作为内标，该方法经过验证并通过了CAP的室间质评测试，方法的准确度及重现性较好。方法的线性范围(0.2～80.0 μg/mL)完全覆盖了本研究的参考范围(1.0～5.0 μg/mL)，且远高于中毒浓度(中毒浓度为>6.0 μg/mL，尤其是>10 μg/mL时)，满足VRC临床药物浓度监测的需求。

VRC受人体吸收、代谢等因素影响，不同患者血药浓度差异较大，尤其是在CYP2C19不同基因型患者体内，血药浓度差异可达3倍，且同一患者不同给药时机的血药浓度也有较大波动[19]。VRC在人体的安全范围相对狭窄[20]。有临床研究显示，VRC谷浓度≥1.0 μg/mL与治疗成功率有关，但若超过治疗窗则神经毒性增加[21]。有研究显示，VRC的肝毒性在亚洲人群中更为普遍，VRC谷浓度≥3.0 μg/mL时，肝毒性风险显著增高[22]。在儿童中，皮疹是最常见的不良反应之一，有研究表明儿童剥脱性皮疹可能是VRC体内暴露量过高导致的毒性反应之一[23]。此外，VRC可能与恶性肿瘤患儿后期可逆性脑白质病变相关[23]。当血清VRC血药浓度因药物间相互作用而异常升高时可能会导致患者醛固酮缺乏，进而发展为高钾血症[24]。本研究回顾性分析了159例患者的VRC血药浓度，48.5%不在治疗范围内，这些患者多为肝功能不全及重症真菌感染。本研究通过对不同年龄段人群VRC血药浓度分布分析发现，人群的个体差异较大，儿童个体差异较成人更显著，尤其是0～2岁低龄儿童，急需VRC血药浓度监测。因此，对肝功能不全及重症真菌感染患者、儿童及老年人群，尤其是0～2岁低龄儿童开展VRC血药浓度监测，对提高治愈率、减少或避免毒性反应的发生具有十分重要的临床意义。