维生素D与儿童孤独症谱系障碍关系的Meta分析

王月，葛冬梅，程茜，代英

(重庆医科大学附属儿童医院，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一组复杂的神经发育障碍性疾病，其核心症状为社会交流、交往障碍，狭隘兴趣及重复、刻板行为[1]。既往研究认为，在美国每59名儿童中就有1名儿童患ASD(患病率约为1.7%)，且近年来患病率有逐渐上升的趋势[2]。ASD具体病因尚不明确，包括了遗传、环境等因素。2016年的一份Meta分析在对包括患ASD双胞胎在内的6 413对双胞胎进行研究后，认为遗传因素在ASD的发病机制中起到了重要的作用[3]。2017年，Sandin S等[4]对在瑞典出生的37 570对双胞胎、2 642 064对全同胞、43 281对同母异父兄弟姐妹和445 531对同父异母兄弟姐妹进行队列研究后发现，ASD遗传力为0.83(95%CI：0.79～0.87)；2015年，一项基于人群的跨国研究结果显示，如果某家庭成员有一个患有ASD的年长兄弟姐妹，那么该成员患ASD的概率较正常值高出8.4倍[5]。说明遗传因素在ASD发病机制中起到了重要的作用。但也有报告指出，母亲孕期的各种环境事件(如暴露于药物等)是ASD的危险因素[6]。ASD核心症状暂无特效治疗药物，目前治疗上主要以教育及行为干预为主[7]。

维生素D是一种常见的脂溶性维生素，主要作用为调节钙磷代谢，从而影响骨骼的生长和发育。目前研究发现，人体内各种组织细胞中广泛分布着维生素D受体，维生素D通过与维生素D受体结合后，除维持矿物质动态平衡外，还起到了促进神经元增殖和分化、调节脑内钙信号以及营养和保护神经等作用[8]。2008年，Cannell J J[9]在一项流行病学调查中指出，美国人ASD患病率逐年增高，且维生素D水平逐年降低，考虑到维生素D对大脑发育的影响，提出了维生素D缺乏可能导致ASD发病的假说。随后，多项研究的结果支持了维生素D可能在ASD的发病中起作用的观点，也有研究认为对维生素D不足或缺乏的ASD患儿行补充维生素D治疗后可以改善ASD的核心症状。鉴于调查ASD患者维生素D水平的研究数量较多，本研究采用Meta分析法，综合国内外2010-2019年有关维生素D水平与ASD关系的病例对照研究，评估维生素D水平与儿童ASD的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料来源

系统检索Medline、EMBase、PubMed、Scopus、the Cochrane Library、EBSCO、Web of Science、中国生物医学文献数据库(CBMdisc)、中国知网(CNKI)、万方数据库、维普等电子数据库，检索词为孤独症和维生素D，检索时限为2010年1月1日至2019年12月31日。中英文检索采用主题词、自由词和布尔逻辑运算符相结合的方式进行检索，其中文检索式(以CNKI为例)为“维生素D”并且“孤独症”或“自闭症”；英文检索式(以PubMed为例)为“25-hydroxyvitamin D” OR “vitamin D” AND “ASD” OR “autism” OR “autism spectrum disorder”。剔除重复文献。所检索文献限中、英文报道，同时追溯所搜集相关文献的参考文献，搜索可能符合收录标准的文献。

1.2 文献纳入标准

所有直接调查ASD患儿和健康对照儿童血清维生素D水平的临床试验都被考虑纳入。(1)研究类型限定为病例对照研究；(2)研究对象年龄为0～18岁；(3)纳入文献的患儿均确诊为ASD，诊断标准符合美国精神障碍诊断统计手册第四版或第五版(DSM-Ⅳ或DSM-Ⅴ)；(4)以健康儿童作为对照组；(5)文献探讨了维生素D与ASD之间的关系，且明确报道了实验组及对照组血清25-羟基维生素D[25-(OH)D]水平的均数和标准差、样本量和P值。血清25-(OH)D水平的检测方式包括液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附试验法、化学发光法等；(6)对同一作者的多篇文献报道，只选取发表时间较晚的文献。

1.3 文献排除标准

(1)无健康对照组；(2)研究中包括任何可能影响血清维生素D水平的疾病；(3)病例报道、综述、评论性文章；(4)重复文献。

通过确定的搜索策略以及全文评估，共检索到相关文献309篇，包括31篇中文文献和278篇英文文献。阅读剔除重复文献，剩余297篇。阅读题目及摘要后初步排除不相干文献，得到20篇文献。再次阅读全文排除 6篇(2篇血清维生素D含量不明确，1篇无健康对照组，1篇数据不全，1篇为同一试验不同时期的结果，1篇研究对象年龄不符合标准)，最终纳入14篇文献[10-23]，文献具体筛选流程见图1。其中中文文献3篇，英文文献11篇，且全部为已正式发表的文献。14篇文献均为病例对照研究，其中8篇为1∶1配比的病例对照研究。研究对象共2 403例(1 135例ASD患儿和1 268例健康对照儿童)，其中研究对象为中东人群的文献6篇，中国人群的文献4篇，欧美地区(不含中东地区)的文献 4篇。各研究设计实验组与对照组时均考虑了患儿性别与年龄分布，两组患儿年龄与性别差异均无统计学意义。使用NOS量表对纳入的14篇文献进行质量评价，结果显示8篇文献7分，6篇文献8分，即所有纳入文献均为高质量文献。纳入研究的基本情况见表1。

课堂1：老师声音清晰，但是紧张，后稍好。准备教学材料充分，讲故事学习单词，较好，但是节奏缓慢。问题太难，提示较少，没有介绍强调具体的事例或语言点，给学生做笔记。(2006年10月9日)

1.4 数据提取

按照纳入标准和排除标准筛选文献后，对作者、发表年份、国家、研究类型、样本特征(样本量、年龄)等资料进行提取。另外，将每个合格研究的维生素D水平数据(包括样本量、均数、标准差和P值)也进行提取，以上数据均提取到Excel电子表格中。

1.5 文献质量评估

(1)维生素D缺乏可能影响儿童大脑早期发育。有研究表明，怀孕期间血清25-(OH)D水平较低的母亲，其子代从怀孕中期到出生时的头围均低于正常值[30]。另有研究指出，孕妇在孕期的维生素D缺乏会对子代在幼儿期的运动及个人-社会能区发育产生负面影响[31]，且如果孕妇从怀孕中期到分娩期间长期处于维生素D缺乏状态，则子代更易出现ASD相关临床特征[32]。在作用机制方面，有学者认为维生素D缺乏可能会削弱周围神经网的完整性，从而扰乱神经回路功能，并阻碍学习和记忆等认知过程[33]。综上所述，有理由认为维生素D缺乏可以导致儿童大脑发育异常。

1.6 数据分析

(4)维生素D缺乏可能会影响5-羟色胺(5-HT)的生成。5-HT是一种重要的神经递质，有研究指出，22%～29%的ASD患者被报道有高5-HT血症，且血清5-HT水平与ASD的严重程度相关，因而5-HT被认为是具有特征性的ASD生物标志物。同时，ASD患儿大脑内5-HT水平偏低，可能与5-HT不能越过血脑屏障有关[40]。而1，25-二羟基维生素D3不仅可以诱导5-HT的合成，提高颅内的5-HT水平，还能促进神经细胞表达色氨酸羟化酶2(TPH2)，并反过来影响外周组织中5-HT的生成[41]。综上所述，维生素D缺乏可能导致血清或大脑中的5-HT水平异常，并参与了ASD的发病机制。

2 结果

2.1 纳入文献基本特征

如LN省所辖市、县在2011—2014年期间出现的财政数据造假事件，征收土地增值税等5671万元，虚增国有资本经营收入6965万元等，辽宁省岫岩县虚增财政收入8.47亿元，超同年实际财政收入的127%。严重干扰了中央对LN省经济形势决策，与其转移支付规模，影响了市县政府的可用财力、民生保障能力。对此，需要进一步加强业务指导和监督检查。

表1 纳入文献的基本特征

图1 文献筛选流程

2.2 ASD与血清25-(OH)D水平的关系

(2)维生素D缺乏可能对ASD患者的免疫反应造成影响。有研究认为，部分ASD患儿的大脑和外周免疫系统存在持续的免疫功能障碍[33]，同时一些炎症标志物(干扰素-γ、白介素-1β、白介素-6、白介素-12和肿瘤坏死因子-α等)的含量也被发现在ASD患儿中明显升高[34]。一项动物研究[35]表明，长期缺乏维生素D会导致小胶质细胞活化，最终引起炎症反应。另有研究[36]指出，补充维生素D能够改善ASD患儿的社交和沟通功能，并调节他们体内的炎症状态。综上所述，有理由认为维生素D缺乏可以影响患儿免疫反应，从而参与ASD的发病机制。

图2 维生素D与儿童孤独症谱系障碍关系Meta分析的森林图

2.3 ASD与血清25-(OH)D水平关于不同人种的亚组分析

众所周知，大型体育赛事的运作管理是跟金钱物资有直接关系的工作，许多项目的竞争都是极为激烈的，如果运作不善就会掉进“糖衣陷阱”，甚至引发各种经济犯罪。因此赛事运作负责人要对运作管理队伍的思想建设引起足够重视，经常性地进行防腐倡廉教育，重视建设规章制度，以及接待、洽谈、维权、物管、财务等方面的工作规范，重视强化审计监督职能，积极主动地邀请审计监督部门定期进行审计工作。

表2 研究对象所属地理位置不同的亚组分析结果

2.4 敏感性分析

使用RevMan 5.3软件进行敏感性分析。采用逐一剔除的方法进行敏感性分析，结果显示依次剔除任意一项研究后，Meta分析合并效应量均未发生明显变化。同时使用Stata 16.0软件进行敏感性分析，其中数值为 -1.23 的垂直线表示总的合并效应量，左右两条垂直线(-1.71，-0.75)则分别表示总的合并效应量95%CI的上下限；每项研究对应的横线表示删除该研究后剩余其他研究的合并效应量。结果发现，去掉任意一项研究，对总体合并效应量均无明显影响，见图3。综上所述，可以认为本研究结果较为稳定。

图3 敏感性分析

2.5 发表偏倚分析

使用RevMan 5.3软件绘制漏斗图，结果显示这14项研究的漏斗图图形略有不对称。进一步采用Egger’s test进行发表偏倚分析，结果显示P=0.131(>0.05)，即认为在这项Meta分析中不存在明显的发表偏倚。见图4。

图4 维生素D与儿童孤独症谱系障碍关系Meta分析的漏斗图

3 讨论

本研究采用Meta分析法，共纳入14项研究，定量分析了血清维生素D水平与ASD发病风险的相关性，结果表明与对照组相比，ASD患儿的25-(OH)D血清浓度显著降低。亚组分析结果显示，中国及中东人群中ASD患儿的25-(OH)D血清浓度较对照组显著降低(P中国人群<0.01，P中东人群=0.04)，欧美(不含中东地区)人群中ASD儿童的25-(OH)D血清浓度较对照组也有降低，但差异无统计学意义(P=0.07)。这提示ASD患儿维生素D水平降低与种族有一定关联。因此，ASD可能引起患儿维生素D水平降低，原因可能与环境和(或)遗传因素有关，具体机制可以通过维生素D摄入量减少、生成不足及消耗量增加来解释。ASD患儿常有兴趣狭隘，这使得他们可能不喜欢含维生素D较高的食物从而导致摄入量减少；ASD患儿可能不喜欢户外活动，导致维生素D合成减少；又或者胃肠道疾病在ASD患儿中较常见[24-25]，消化、吸收维生素D的能力减弱，最终导致ASD患儿体内维生素D水平较低。目前ASD引起维生素D缺乏这一结论仍然缺乏临床证据支持，仍需进一步完善相关科学实验以进一步探究。

另外，维生素D缺乏可能是ASD的病因。美国一项儿童孤独症环境和遗传风险(childhood autism risks from genetics and the environment，CHARGE)研究[26]结果表明，部分与维生素D代谢相关的基因异常不仅仅会引起维生素D水平降低，还会增加ASD的发病率。澳大利亚的一项研究[27]发现，怀孕18周时，孕妇体内25-(OH)D浓度降低可能导致后代患ASD的风险显著增加。无独有偶，鹿特丹市的一项研究[28]表明，孕妇在妊娠中期维生素D缺乏可导致子代患ASD的风险增加2倍以上。另有一项流行病学研究[29]表明，居住在紫外线渗透率较低地区的儿童患ASD的概率较居住在阳光充足地区的儿童高出3倍左右，而阳光中的紫外线照射是人体合成维生素D的重要条件之一。这都为维生素D参与ASD的发病机制提供了依据。维生素D水平降低参与ASD的发病机制的方式存在以下几种可能。

主动学习原本是人类最基本的本能，要对事物认知首先要有来自于本能的冲动，如果依照这种冲动去安排传授和学习，那是符合认识规律以及学生心理机制的。但大多数时间里，我们并不了解这一冲动，而是主观地想像我们教育对象的需求，安排我们自以为系统有效的计划。这是影响学生主动学习的根本原因。

使用纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastle-Ottawa quality assessment scale，NOS)对纳入的所有研究进行质量评估。NOS量表包括三个方面：(1)选择；(2)可比性；(3)暴露。NOS评分从0分(最低)到9分(最高)，根据评分结果可将研究分为两类：低质量研究(0～6分)和高质量研究(7～9分)。

对研究对象所属地理位置按照中国、中东、欧美(不含中东国家)进行亚组分析。亚组分析结果显示，中国及中东亚组分析结果均支持ASD组与对照组血清维生素D含量存在差异，欧美(不含中东国家)亚组分析结果认为ASD组与对照组血清维生素D含量差异无统计学意义。中国亚组的WMD及其95%CI为-10.81(-16.80～-4.82)，P<0.01；中东亚组的WMD及其95%CI为-9.35(-18.09～-0.60)，P=0.04；欧美(不含中东国家)亚组的WMD及其95%CI为-6.22(-12.87～0.44)，P=0.07。见表2。

纳入的文献中共有14项[10-23]病例对照研究评估了ASD患儿和对照组的血清25-(OH)D水平。总体人群异质性检验结果显示，纳入的各研究间存在高度统计学异质性(χ2=485.91，P<0.01，I2=97%)，因此采用随机效应模型进行分析。合并效应量结果显示，在纳入的 14篇文献中，有13篇文献[10，12-23]认为ASD患儿的 25-(OH)D 水平明显低于对照组，1篇文献认为两者之间无显著差异[11]。合并资料显示，ASD组与对照组血清维生素D含量比较差异有统计学意义(WMD=-8.91，95%CI：-12.45～-5.37，P<0.01)。见图2。

(3)维生素D缺乏可能与线粒体功能障碍和氧化应激有关。有研究已经确认，ASD患儿的线粒体功能障碍的频率明显高于普通人群，这提示线粒体功能在ASD的发病机制中起作用。而线粒体不仅可以提供三磷酸腺苷(ATP)，还通过ATP的产生调节钙稳态，并清除活性氧(ROS)[37]。与此同时，ASD患儿的淋巴细胞和粒细胞的线粒体H2O2产量均明显高于健康儿童[38]，这表明ASD患儿的大脑更易暴露在氧化应激中。另有研究表明，FoxO1基因过表达可导致线粒体功能障碍并产生ROS，而维生素D可以沉默FoxO1基因，并减轻或者逆转ROS诱导的细胞凋亡[39]。综上所述，维生素D缺乏可能导致大脑内线粒体功能障碍和更高水平的氧化应激，这有可能参与了ASD的发病机制。

按照Meta分析要求整理文献，采用RevMan 5.3软件和Stata 16.0软件汇集来自符合条件的文献的所有数据，以进行数据分析。在每个符合条件的研究中，使用加权均数差(WMD)及其95%可信区间(95%CI)来描述ASD组和对照组之间维生素D平均水平差异的总体效应大小。若各个研究间异质性显著(P<0.10)，则使用随机效应模型(倒方差法)，若各个研究间异质性不显著(如I2>75%)，则使用固定效应模型。为了评估单个数据集对合并的WMD的影响，通过一次删除一项研究的方法进行单向敏感性分析，并绘制漏斗图直观检测发表偏倚，以及使用Egger’s test进一步评价可能的发表偏倚。

(5)维生素D缺乏可能会导致类固醇代谢异常。既往研究表明，在ASD儿童出生时的羊水中观察到包括孕酮、17α-羟孕酮、雄烯二酮、睾酮和皮质醇在内的多种类固醇水平升高，且ASD患儿出生后唾液中的雄激素水平明显高于对照组。有学者提出假设：产前雄激素暴露与幼儿ASD的发展有关[27]。而维生素D已被证明可以调节许多类固醇的表达和合成。在体外试验中，维生素D已被证明能够调节类固醇生成酶的表达，包括减少雄烯二酮、脱氢表雄甾酮(DHEA)、DHEA-硫酸盐和皮质酮的合成；上调睾酮分解代谢酶HSD17β2；对睾酮的主要分解代谢酶——芳香化酶的表达有组织特异性影响[42]。综上所述，维生素D缺乏可能导致类固醇代谢异常，从而参与ASD的发病机制。

(6)维生素D缺乏可能增加遗传突变的风险。既往研究认为，新生突变是影响ASD的重要遗传因素，而维生素D缺乏会下调DNA修复基因的表达，因此可能阻碍适当的DNA修复[43]。因此，有理由推测ASD患儿的新发基因突变与维生素D缺乏有关。

“速裁”而不“滥裁”，法律兼顾温情，李凌说：“法槌敲响的那一刻对社会应该有一种警醒和指引，达到法律效果与社会效果的统一。一起案件的审判，不应该仅仅只是为了把人‘关进去’。”

（1）在员工的“企业社会责任效果”评价中，本文依据文献，设计出如下二级评价指标：企业的社会责任政策非常符合员工的预期（V111）、员工与组织之间的关系很融洽（V112）、企业社会责任提高了企业的运营成本（V113）。

总之，ASD患儿维生素D水平较低的具体原因还需进一步探究。尽管本Meta分析包含的14篇研究主要探究维生素D水平与儿童ASD的关系，但仍有1篇探讨了维生素D对儿童ASD的干预治疗效果。Saad K等[19]在对83例合并维生素D缺乏的ASD患儿进行了长达3个月的口服维生素D3(5 000 IU/d)治疗，结果显示80.72%的ASD患儿在补充维生素D后，其儿童孤独症评定量表(childhood autism rating scale，CARS)总分较治疗前显著下降，提示补充维生素D(2 000 IU/d)对改善ASD患儿核心症状有效。Mazahery H等[44]在2018年的一份RCT中证实，补充维生素D能减轻合并维生素D缺乏的ASD患儿易怒和过度活动的临床症状。Feng J等[45]在2017年的研究中表明，在对存在维生素D缺乏或者维生素D不足的ASD患儿补充维生素D(肌肉注射15万IU/月，以及口服400 IU/d)后，孤独症患儿行为检查表(autism behavior checklist，ABC)总分及CARS总分均较治疗前显著下降，这提示患儿ASD核心症状得到改善。但也有RCT研究补充维生素D后未观察到ASD核心症状的有意义变化[46]。维生素D对儿童ASD的干预治疗效果尚需进一步论证。

本研究仍存在一定的局限性。纳入的14篇文献之间异质性仍然显著，这提示不能排除可能存在的选择性偏倚。分析具体原因，可能是各研究之间测量血清维生素D浓度不同、各研究之间研究对象的人种不同、各研究之间研究对象所处地理位置以及光照强度存在差异等。其次，本研究只包含了中文及英文文献，这可能会导致一定的发表性偏倚。尽管如此，Meta分析结果仍然显示，ASD患儿中存在不同程度的维生素D缺乏，提示有必要对临床诊断ASD的患儿检测血清维生素D含量，并评估是否需要补充维生素D制剂。虽然本研究提示ASD患儿血清维生素D含量普遍较低，但现今维生素D充足的标准仍然有待商榷。目前认为血清25-(OH)D浓度介于30～50 ng/mL可判定维生素D含量充足[47]，而针对ASD患儿，是否需要在维生素D含量充足的情况下补充维生素D制剂，还需要进一步的研究。