小檗胺在体内外对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用及机制研究

刘丽丽 严佳栋 许晓东 徐志英 曹莺

肝癌的发病率在全球癌症中排名第5位，在癌症导致的死亡率中排名第二[1]。在世界范围内，中国的肝癌发病率最高，每10万人口中，约有25.7人新诊断为肝癌[2]。肝癌的治疗手段包括化疗、肝切除术、肝移植和免疫治疗等。随着科技的发展，尽管对肝癌的研究取得了很多进展，但是在发展中国家，肝癌的治愈率很低。这就需要寻找新的、疗效更好、更低的药物来治疗肝癌。小檗胺是从小檗等中草药中分离得到的一种双苄基异喹啉类生物碱。盐酸小檗胺片在临床上用于治疗白细胞减少症，且无明显的不良反应[3]。近年来，研究发现小檗胺拥有抗肿瘤活性，能够抑制肺癌细胞的增殖[4]、抑制乳腺癌细胞的侵袭转移[5]、诱导肝癌细胞的凋亡[6]。然而，小檗胺在体内对肝癌的作用目前还没有研究。卵巢肿瘤相关蛋酶B1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein B1，OTUB1)隶属于去泛素化酶(DeUbiquitinating Enzymes，DUB)超家族，在人类肝、肾、脑等组织中广泛表达。研究表明，OTUB1在非小细胞肺癌及肝癌细胞中表达上调[7,8]，在肝癌患者中，OTUB1的表达量与肝癌的TNM分期、转移性明显相关，OTUB1表达量越高，TNM分期值越大，肝癌患者越容易发生转移，患者的预后越差。另外，研究表明OTUB1能够抑制抗凋亡蛋白p53的表达[9]，p53是抑癌基因，在维持细胞完整性和防止细胞癌变中发挥重要作用。但是截至目前，还没有研究表明小檗胺抑制肝癌的作用与OTUB1有关。我们假设小檗胺能够在体内外抑制肝癌细胞系SMMC-7721的增殖、侵袭转移，并且这种作用可能是通过调节OTUB1的表达来实现的。

1 材料与方法

1.1 试剂 小檗胺购自上海诗丹德生物技术有限公司(批号：1895，纯度>98%)。制备成浓度为100 mmol/L的储存液，在每次试验中用细胞培养液稀释到所需浓度。环磷酰胺(货号：PHR1404)购自Sigma。胎牛血清(FBS，批号：SV30087.02-NZJ1221)购自Hyclone，RPMI培养液(货号：2141287)购自Gibco。抗体p53(批号：GR136120-36)购自Abcam，OTUB1(批号：A1618)、caspase-3(货号：sc-7272)、Bcl-2(货号：sc-578)、Bax(货号：sc-7480)和β-actin(货号：sc-8432)购自 Santa Cruz Biotechnology。Western相关试剂如裂解液BCA试剂盒(货号：P0012)、蛋白酶抑制剂(PMSF，货号：ST506)、电泳液(货号：P1004D)、转膜液(货号：P0021B)来自于碧云天，ECL发光试剂盒(货号：WBKLS0500)购自milippore。

1.2 仪器 高速离心机(型号：Heraeus fresco 17，Thermo，美国)，二氧化碳培养箱(型号：SHELLAB 3517/21，Thermo，美国)，荧光倒置显微镜(序列号：SN409396，徕卡，德国)，多功能酶标仪(序列号：SN3001-2228，Thermo，美国)，ECL发光仪(序列号：SN7218R11306，Bio-Rad，美国)，电泳仪、转膜仪(型号：MP4，Bio-rad，美国)，-80℃冰箱(型号：MDF-U3386S，三洋，日本)。

1.3 方法

1.3.1 细胞株:肝癌细胞株SMMC-7721，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。置于RPMI 1640培养基(含10% FBS，1%青链霉素)中，于37℃、含5% CO2的培养箱中培养，每2天传代换液1次，选用对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 实验动物:BALB/c裸鼠，雄性，6周龄，购自江苏集萃药康生物技术有限公司[合格证号：SCXK (苏)2018-0008]。饲养于SPF级动物房内。

1.3.3 MTT试验:取对数期的SMMC-7721细胞加入96孔板(1×104个细胞/孔)中过夜，轻轻把培养液吸去，每孔加入不同浓度的小檗胺(溶剂对照、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)的培养液180 μl，将细胞置于37℃培养箱中分别培养24 h、48 h和72 h，然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)在37℃孵育4 h，小心吸去上清，每孔加入150 μl DMSO，脱色震荡10 min，用酶标仪在560 nm波长处检测OD值。

1.3.4 划痕试验:将SMMC-7721细胞(1×105个细胞/孔)种于6孔板中培养。当细胞铺到80%满的时候，用200 μl的枪头在单层细胞上划一条直线，用PBS轻轻地洗去漂浮的细胞，加入含不同浓度小檗胺(溶剂对照、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)和阳性药(环磷酰胺30 μmol/L)的完全培养液，将细胞置于37℃培养箱中孵育。在划线后的0 h和24 h，用倒置显微镜拍照。用NIH Image J软件计算划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕-24 h划痕面积)/0 h划痕面积。为了排除细胞增殖对实验的影响，在加入药物时，每孔细胞中加入丝裂霉素(1.0 μg/ml)。

1.3.5 体内实验:用BALB/c裸鼠建立皮下移植肿瘤模型。按照《实验动物管理条例》有关规定，在SPF级动物房内饲养裸鼠。待裸鼠适应环境1周后，取对数期的SMMC-7721细胞(1×107个)注射于裸鼠的右后侧皮下。接种3 d后，每天用游标卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(W)，计算肿瘤体积(V)，V = W2×L/2。肿瘤体积长到150 mm3时，将动物随机分成溶剂对照组、阳性药组(环磷酰胺，50 mg/kg)和小檗胺组(20 mg/kg)，通过腹腔注射的方式给药，每隔1 d记录裸鼠体重、肿瘤体积。连续记录20 d。在末次给药后，将动物处死，剥离肿瘤组织用于western试验。

1.3.6 Western Blot试验:将SMMC-7721细胞和动物肿瘤组织用裂解液(含1 mmol/L PMSF)裂解，提取总蛋白。将裂解后的蛋白用BCA试剂盒进行蛋白定量。将总蛋白(20 μg)在10%的SDS-PAGE胶上进行分离，然后转移到PVDF膜上，再用含5 %脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭2 h，然后孵一抗OTUB1(1∶1 000稀释)、p53(1∶1 000稀释)、caspase-3(1∶1 000稀释)、Bcl-2(1∶500稀释)、Bax(1∶1 000稀释)和β-actin(1∶2 000稀释)4℃过夜，用TBST洗涤3次，室温孵二抗(1∶10 000稀释)2 h，再用TBST洗涤3次，用ECL发光仪检测显影，ECL发光仪采集图像，用NIH Image J软件计算灰度值。

2 结果

2.1 小檗胺抑制SMMC-7721细胞的增殖 小檗胺以浓度依赖和时间依赖的方式抑制SMMC-7721细胞的增殖，小檗胺处理细胞的时间越长，对细胞发挥增殖抑制的浓度越低，用小檗胺处理SMMC-7721细胞24 h、 48 h和72 h时，与对照组比较，小檗胺明显抑制SMMC-7721细胞增殖的最低浓度分别是20 μmol/L(P<0.05)、10 μmol/L(P<0.05)和1.25 μmol/L(P<0.05)。小檗胺处理SMMC-7721细胞72 h时，抑制细胞增殖的IC50为17.4 μmol/L。见表1，图1。

表1 小檗胺对SMMC-7721细胞增殖能力的影响

2.2 小檗胺抑制SMMC-7721细胞的迁移 用划痕试验评价小檗胺对SMMC-7721细胞迁移的影响，在划痕后24 h，与对照组比较，阳性药能够明显降低SMMC-7721细胞的划痕愈合率(P<0.01)，对照组24 h的划痕愈合率为(74.1±10.3)%，阳性药组24 h的划痕愈合率为(9.5±2.1)%，10 μmol/L的小檗胺、20 μmol/L的小檗胺和40 μmol/L的小檗胺能够明显抑制SMMC-7721细胞的侵袭转移，10 μmol/L小檗胺组、20 μmol/L小檗胺组和40 μmol/L小檗胺组24 h的划痕愈合率分别为(60.4±6.9)%(P<0.05)，(21.4±5.2)%(P<0.01)和(8.7±1.8)%(P<0.001)。见图1，表2。

表2 小檗胺对SMMC-7721细胞侵袭转移的影响

图1 小檗胺对SMMC-7721细胞侵袭转移的影响，用划痕试验检测小檗胺对SMMC-7721细胞侵袭转移的影响(拔=100 μm)

2.3 小檗胺对SMMC-7721细胞中OTUB1等蛋白表达的影响 用western blot试验用来检测小檗胺对SMMC-7721细胞OTUB1等蛋白表达的影响。试验结果显示，与对照组比较，20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能够明显下调OTUB1的表达，下调率分别为(39.4±4.3)%(P<0.01)和(65.6±2.4)%(P<0.001)。10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能够明显下调Bcl-2/Bax的表达(P<0.01)，下调率分别为(29.1±10.2)%(P<0.05)、(40.8±4.4)%(P<0.01)和(79.9±2.3)%(P<0.01)。与对照组比较，20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能够上调p53的表达，上调率分别为(60.9±17.9)%(P<0.05)和(105.2±18.7)%(P<0.05)。10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能够明显上调cleaved-caspase-3/caspase-3的表达，上调率为(57.6±12.3)%(P<0.05)、(96.7±8.3)%(P<0.01)和(123.6±7.1)%(P<0.001)。见图2。

图2 小檗胺对SMMC-7721细胞OTUB1等蛋白表达的影响。用western blot试验来检测p53、OTUB1、Bcl-2/Bax、和cleaved-caspase-3/caspase-3的表达

表3 小檗胺对SMMC-7721细胞OTUB1等蛋白表达的影响

2.4 小檗胺在体内对肿瘤生长及转移的影响 用皮内移植肿瘤模型评价小檗胺对SMMC-7721细胞移植肿瘤的生长及转移的影响。试验结果表明，与对照组比较，在给药12 d后，阳性药环磷酰胺组动物的肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01)，给药16 d后，小檗胺组动物的肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05)。直到试验结束，各组裸鼠的体重差异无统计学意义(P>0.05)。给药20 d后，将动物处死，剥离肿瘤组织和肝脏组织，与对照组比较，阳性药环磷酰胺组和小檗胺组的肿瘤重量明显小于对照组(P<0.05)。对照组肝表面节点数较多，而小檗胺组和阳性药环磷酰胺组肝脏上的节点数相较于对照组明显减少(P<0.05)。见图3，表4～6。

图3 小檗胺在体内对肿瘤增殖、转移的影响；A 小檗胺对裸鼠肿瘤生长的影响；B 小檗胺对肝脏表面结节数的影响(箭头所指为肝脏表面结节)

表4 小檗胺对肿瘤体积的影响

表5 小檗胺对肝裸鼠体重的影响

表6 小檗胺对肿瘤重量及转移的影响

2.5 小檗胺对肿瘤组织中OTUB1等蛋白表达的影响 用western blot试验检测小檗胺对肿瘤组织中OTUB、p53等蛋白表达的影响。试验结果显示，与对照组比较，小檗胺能够明显下调OTUB1(P<0.01)和Bcl-2/Bax(P<0.01)的表达，下调率分别为(56.3±6.8)%和(50.1±8.3)%。小檗胺能够显著上调p53(P<0.05)和cleaved-caspase-3/caspase-3(P<0.01)的表达，上调率分别为(99.1±30.3)%和(83.1±16.2)%。见图4，表7。

图4 小檗胺对肿瘤组织中OTUB1等蛋白表达的影响；用western blot试验来检测p53、OTUB1、Bcl-2/Bax、和cleaved-caspase-3/caspase-3的表达

表7 小檗胺对肿瘤组织中OTUB1等蛋白表达的影响

3 讨论

肝癌在全球导致死亡的癌症中处于第二位，每年有80万患者确诊为肝癌[10]，大多数患者在肿瘤已经发展到晚期时才得到诊断，常见的治疗手段包括手术切除、原位肝移植或局部肝移植等治疗方法。肝癌的进展受细胞外因子和细胞内信号转导通路的控制[11]。因此，阐明肝癌的发生发展机制，开发新的治疗肝癌的药物会为肝癌提供新的治疗方法。

泛素化酶通过改变蛋白底物的泛素化状态来调节多种生物学过程，其中许多生物学过程与癌症的发展紧密相关。OTUB1是去泛素化酶家族的一员，它通过调控多种癌症相关信号通路，包括MAPK、ERa、EMT、RHOa、mTORC1、FOXM1和P53等促进肿瘤细胞存活、增殖、侵袭转移和治疗抵抗性等[12]。OTUB1在多种肿瘤类型包括肺癌、乳腺、卵巢、胶质瘤、结肠癌和胃癌中高表达[13-16]。研究显示，骨髓瘤细胞的凋亡增加与OTUB1的表达下调密切相关[17]，miR-542-3p通过抑制OTUB1来抑制结肠癌细胞的增殖与侵袭转移[18]，另外，OTUB1能够促进卵巢癌的侵袭转移[16]。此次研究结果显示小檗胺在体外能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖与侵袭转移(P<0.05)。在体内，下檗胺能够明显抑制SMMC-7721细胞移植生成的肿瘤的生长(P<0.05)，而且小檗胺能够使肝脏表面的结节数减少，降低肿瘤的重量，此外，western的实验结果小檗胺在体内与体外实验中均能使SMMC-7721细胞及肿瘤组织中OTUB1的表达下调，这与文献的研究结果一致。结合参考文献，我们可以得出小檗胺在体内外均能抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖与侵袭转移，这种作用可能是通过调控OTUB1的表达来实现的。抑癌基因p53可以抑制肿瘤细胞的生长与增殖，它通过转录激活或抑制很多目标基因的靶蛋白，从而导致细胞周期停滞，细胞死亡和衰老等，也可以直接触发线粒体介导的细胞凋亡。p53可以直接与促生存家族Bcl-2结合，释放出Bax，Bax根据Bax应激状态发挥促凋亡或抗侵袭转移功能[19]。研究表明在结肠癌细胞中，OTUB1的抑制会导致p53的表达上调[19]，我们的研究显示小檗胺能够抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖与侵袭转移，能够下调OTUB1的表达与Bcl-2/Bax的比例，上调p53的表达，这与文献报道一致。此外，caspase3在细胞调亡与增殖中发挥重要作用[19]，因此，我们检测了caspase-3的表达，western的试验结果显示cleaved-caspase3/caspase3的比例上调，说明小檗胺可能通过调控caspase-3的表达来抑制细胞的增殖、诱导细胞的凋亡。综上，小檗胺可能是通过抑制OTUB1的表达，进一步调控p53、Bcl-2/Bax的比例来来抑制SMMC-7721细胞的增殖、侵袭转移。以及调控cleaved-caspase3/caspase3的比例来影响促进凋亡，进而抑制细胞增殖。

小檗胺能够抑制肝细胞SMMC-7721的增殖和侵袭转移，这种作用可能是通过调控OTUB1的表达，进一步调控p53、Bcl-2/Bax和caspase的表达来实现的。