云南不同高原富营养化湖泊噬藻体g20基因遗传多样性研究

蔡一鸣，刘玉珊，王志龙，李春筱，刘 丽

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

噬藻体(Cyanophage)是一种能够特异性感染蓝藻的双链DNA病毒，在淡水及海洋环境中广泛存在，是水生微生物群落的重要组成部分，能在不同时间和空间范围内感染蓝藻，具有丰富的遗传多样性[1]。噬藻体通过侵染宿主蓝藻改变宿主的种群结构，调控蓝藻丰度、多样性及群落结构演替，在控制蓝藻引起的水华方面具有巨大的开发潜力。

对于噬藻体的研究始于20世纪60年代, 自1963年SAFFERMAN等[2]成功分离出第1株噬藻体LPP后，研究者们采用传统的分离纯化方法已获得一系列侵染不同蓝藻的噬藻体，并对其生物学特性等进行相关研究[3-5]。根据噬藻体形态的不同，可将其分为肌尾噬藻体科(Myoviridae)、短尾噬藻体科(Podoviridae)和长尾噬藻体科(Siphoviridae)[6]。噬藻体基因具有高度差异性，且缺乏广泛通用的分子标记，导致噬藻体的遗传多样性研究较为困难，选择适合的靶基因成为噬藻体分子生态学研究的关键[7]。g20基因能够编码大肠杆菌T4型噬菌体衣壳组装蛋白，具有高度的保守性，目前被广泛用于肌尾科噬藻体的多样性研究。ZHONG等[8]根据g20基因设计引物CPS1 /CPS8，成功地从噬藻体分离株和环境病毒浓缩物样品中扩增出片段长度为592 bp的g20基因片段，并对其进行系统进化地位分析。MARSTON等[9]比较了g20基因3 对引物发现，CPS1/CPS2 引物扩增范围较CPS1/CPS4 和CPS1/CPS8 更加广泛。SULLIVAN等[10]重新设计了g20引物CPS1.1 /CPS8.1，对分离筛选到的所有肌尾科噬藻体都成功扩增得到g20基因。g20基因作为噬藻体的一种靶标基因，不仅可以用于研究噬藻体的遗传多样性，还可以探究噬藻体与其宿主及浮游病毒之间的基因多样性关系。

近年来，湖泊富营养化已经成为国内外普遍关注的环境问题。云南是一个淡水资源极为丰富的省份，湖泊众多且类型多样，但人为活动和自然环境原因引起的水体富营养化问题也越来越突出[11]。贫营养化抚仙湖和富营养化湖泊滇池、星云湖之间环境因子差异明显，滇池、星云湖水体的化学需氧量和溶解氧，叶绿素a，氮、磷浓度均高于抚仙湖，因此富营养化程度也远高于抚仙湖。有关噬藻体多样性及其生态作用的研究一直倍受关注，研究噬藻体多样性有助于了解噬藻体及其与宿主蓝藻的关系，从而促进其对蓝藻水华的治理。研究选取云南高原湖泊中3个富营养化程度不同的淡水湖泊滇池、星云湖和抚仙湖，采用PCR-克隆技术对噬藻体g20基因多样性进行分析，研究不同湖泊噬藻体g20基因多样性，以期更深入了解噬藻体遗传多样性，发现噬藻体新的基因型。

1 材料与方法

1.1 水样采集与处理

于2018年秋(10月)、2019年冬季(1月)，在云南滇池、星云湖和抚仙湖使用专用的水样采集器，分别于表层(距水体表面约 0.5 m 处)和底层(距水体表面约 2 m处)采集水样，每个采样点多点采集水样后置于灭菌聚乙烯瓶或玻璃瓶中，并迅速运送回实验室，将采集的水样混合后依次通过0.45、0.22 μm 微孔滤膜处理，使用中空纤维膜组件进行浓缩，浓缩比例为300∶1，将浓缩水样置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 噬藻体DNA的提取及PCR扩增

使用病毒基因组提取试剂盒〔E.Z.N.A.TMViral DNA Kit(OMEGA)〕提取浓缩水样噬藻体DNA，将提取好的DNA保存于-20 ℃ 冰箱中。选择噬藻体g20基因引物进行PCR扩增，扩增引物为CPS1.1/CPS8.1[10]：g20-F(5′- GTAGWATWTTYTAYATTGAYGTWGG-3′)和g20-R(5′-ARTAYTTDCCDAYRWAWGGWTC-3′)。PCR扩增体系为：2×Premix Taq (TaKaRa)10 μL，Primer-F Primer(10 μmol·L-1)1 μL，Primer-R Primer (10 μmol·L-1) 1 μL，Template(sample) 2 μL，Rnase Freed H2O 6 μL，总体积为20 μL。以阴性对照无菌 ddH2O为模板。PCR扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s；退火30 s(45 ℃)；72 ℃延伸60 s；35个循环；72 ℃延伸 10 min。

1.3 回收TA克隆及测序

使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)对PCR产物进行纯化，使用pEASY ©-T1 Cloning Kit(TransGen Biotech)对纯化的PCR产物进行连接与转化，通过菌落PCR扩增对阳性克隆进行筛选和鉴定，并将阳性菌液送至测序公司(昆明硕擎生物公司)测序。

1.4 系统进化分析

将测序得到的噬藻体g20基因序列经NCBI Blast比对后，使用软件Clastal对得到的噬藻体g20基因序列和g20基因参考序列进行比对，使用软件Mega7构建g20基因系统进化树，进行遗传多样性分析。笔者将获得的g20基因序列标注为“湖泊+季节+第几条序列”，例如抚仙湖秋季序列的第3条标注为“FXa-3”，星云湖冬季序列的第5条序列为“XYw-5”。获得的序列已提交NCBI网站，其序列号为MW032215-MW032257。

2 结果与分析

2.1 不同湖泊水样中噬藻体g20基因PCR扩增及克隆测序

对滇池、星云湖和抚仙湖秋冬季浓缩水样提取DNA，使用噬藻体g20基因的引物进行PCR扩增，在g20基因扩增结果的600 bp位置处有明显条带(图1)，与g20目的基因片段长度相符。对PCR产物胶回收经TA克隆筛选，以抚仙湖样品g20基因PCR扩增结果(图2)为例，不同湖泊g20基因菌液PCR扩增结果均在600 bp位置处有明显条带。将阳性菌液送至测序公司测序，得到43条g20基因环境序列，其中抚仙湖g20基因序列共21条(秋季7条，冬季14条)，滇池g20基因序列共14条(秋季7条，冬季7条)，星云湖g20基因序列共8条(秋季4条，冬季4条)。

2.2 不同湖泊水样中噬藻体g20基因同源性分析

在 NCBI 网站上，基于核苷酸水平BLAST 比对结果可以看出，该研究获得的 43 条g20基因环境序列与报道的其他环境来源的噬藻体g20序列的相似度为74%～100%(表1)。有22条g20基因序列与武汉东湖水体中噬藻体g20基因序列相似性最高，相似度为74%～98%，有8条g20基因序列与美国伊利湖水体中噬藻体g20基因序列相似性最高(83%～99%)，2条与新加坡克兰芝水库水体中噬藻体g20基因序列具有最高相似性(91%～92%)，3条g20基因序列与法国阿尔卑斯山湖泊水体中噬藻体g20基因序列具有最高相似性(92%～94%)，1条g20基因序列与日本稻田中噬藻体g20基因序列具有最高相似性(83%)，7条g20基因序列与滇池水体中噬藻体g20基因序列具有最高相似度(82%～100%)。滇池秋季的7条g20基因序列(DCa2-4、DCa5-7、DCa11)与已报道序列滇池水体克隆(OTU20SMay-M-1-98)、武汉东湖水体克隆(g20_DH07/2012_1、g20_DH07/2012_7)具有较高相似性(74%～100%)；滇池冬季的7条g20基因序列(DCw1、DCw3-4、DCw7、DCw11、DCw13-14)与已报道序列日本稻田水体克隆(PFW-CM13)、滇池水体克隆(OTU11NApr-XA-1-3)、武汉东湖水体克隆(g20_DH06/2012_18)具有较高相似性(76%～83%)。抚仙湖秋季的7条g20基因序列(FXa1-4、FXa6-8)与已报道序列美国伊利湖水体克隆(45202CPSCC14)、武汉东湖水体克隆(g20_DH10/2012_28)具有较高相似性(89%～99%)；抚仙湖冬季的14条g20基因序列(FXw3-6、FXw8-14、FXw16、FXw18-19)与已报道序列美国伊利湖水体克隆(45202CPSCC14)、武汉东湖水体克隆(g20_DH06/2012_18、g20_DH11/2012_25、g20_DH10/2012_28)、法国阿尔卑斯山湖泊水体克隆(LAB_g20_b30_A3)、新加坡克兰芝水库水体克隆(KRB0109M2、KRB1208M3)具有较高相似性(75%～99%)。星云湖秋季的4条g20基因序列(XYa1-2、XYa7-8)与已报道序列武汉东湖水体克隆(g20_DH09/2012_5、g20_DH06/2012_18、g20_DH04/2013_43)具有较高相似性(77%～98%)；星云湖冬季的4条g20基因序列(XYW1-2、XYW4、XYW12)与武汉东湖水体克隆(g20_DH06/2012_18、g20_DH04/2013_43)具有较高相似性(76%～78%)。

表1 云南不同高原湖泊g20基因与 NCBI 数据库在核苷酸水平的同源性比较

2.3 不同湖泊水样中噬藻体g20基因系统进化分析

对从云南滇池、星云湖和抚仙湖获得的43条噬藻体g20序列构建系统进化树(图3)，所有序列可划分成5个进化簇(Cluster Ⅰ～Ⅴ)，Cluster Ⅰ包括7条抚仙湖g20序列和8条滇池g20序列；Cluster Ⅱ包括8条抚仙湖g20序列和4条滇池g20序列，1条星云湖g20序列；Cluster Ⅲ包括2条抚仙湖序列、2条星云湖序列和1条滇池序列；Cluster Ⅳ包括2条星云湖序列、1条抚仙湖序列和1条滇池序列；Cluster Ⅴ包括3条星云湖序列和3条抚仙湖序列。其中星云湖和抚仙湖噬藻体g20基因序列分布于多个进化簇中(星云湖序列分布于ClusterⅡ～Ⅴ；抚仙湖序列为ClusterⅠ～Ⅴ)；滇池g20序列主要分布在ClusterⅠ～Ⅱ中。从季节上来看，滇池秋季g20序列分布在ClusterⅠ～Ⅲ中；抚仙湖秋季g20序列分布在ClusterⅠ、Ⅲ～Ⅴ中；星云湖秋季g20序列分布在Cluster Ⅲ～Ⅴ中。抚仙湖与星云湖分布趋势大致相同，但抚仙湖秋季g20序列多样性更显著。滇池冬季g20序列分布在ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅳ中；抚仙湖冬季g20序列分布在ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅴ中；星云湖冬季g20序列分布在ClusterⅡ、Ⅲ、Ⅴ中。

对该研究获得的g20基因序列与已报道的其他湖泊中的噬藻体g20序列构建系统进化树(图4)，可划分为2个大簇(Cluster α、Cluster β)，云南高原3个湖泊水体中大部分g20基因序列分布在Cluster β，而其他湖泊包括武汉东湖、滇池、美国伊利湖、新加坡克兰芝水库和法国布尔热湖等湖泊水体中g20基因序列分布在Cluster α，表明云南高原湖泊与其他不同湖泊环境中肌尾科噬藻体g20基因组成存在一定差异。

对该研究获得的噬藻体g20基因序列和NCBI 数据库中稻田、淡水和海洋噬藻体、未培养的噬藻体g20基因参考序列构建系统进化树。如图5所示，所有序列被划分成7个簇(Cluster A～G)。Cluster A 包括中国杞麓湖、科威特海洋沿岸、墨西哥湾海洋环境未培养噬藻体的g20序列和该研究得到的2条星云湖g20序列、8条滇池g20序列和8条抚仙湖g20序列，其中3条抚仙湖、星云湖g20序列单独形成1个亚簇(A2)。

Cluster B包括汕头沿海、美国佐治亚州萨凡纳河口、大西洋萨加索海等海洋未培养的噬藻体g20序列以及滇池g20序列1条、抚仙湖g20序列2条、星云湖g20序列2条。Cluster C包括美国巴尔博亚岛沿海海洋、俄罗斯贝加尔湖噬藻体g20序列和抚仙湖、星云湖g20序列各2条；Cluster D包括中国东湖未培养的噬藻体g20序列和该研究的5条滇池g20序列、1条星云湖序列和8条抚仙湖序列，其中DCw-1单独形成1个分支，可能为新的基因型。Cluster E、F和G包括来自淡水湖、我国东北稻田、日本稻田及海洋水体的噬藻体g20序列类群。研究获得的大部分序列分布于Cluster A～D(滇池g20序列分布于Cluster A～B、D，抚仙湖g20序列分布于Cluster A～D、G，星云湖g20序列分布于Cluster A～E)，与湖泊、海洋序列共处于不同进化簇中，推测高原湖泊水体中肌尾科噬藻体的g20基因群集与海洋、湖泊环境中具有较近的亲缘关系，但远离稻田水体g20序列的分布。从3个湖泊秋冬季采集水样获得的g20基因序列分布看，各湖泊秋冬季g20基因遗传多样性无明显差异。

3 讨论

根据噬藻体g20基因已设计出不同引物如CPS1/CPS2、CPS1/CPS4、CPS1/CPS8等，随着对其引物的不断优化，利用g20基因已成功地对湖泊、稻田、近海海域、开阔海域及寡营养海域等区域中肌尾科噬藻体基因多样性进行研究。通过分析g20基因不同的PCR扩增引物，发现使用引物CPS1.1/CPS8.1获得的g20基因源于噬藻体，尚不能利用该引物从其他噬菌体中获得g20序列[12]。该研究采用CPS1.1/CPS8.1引物作为噬藻体g20基因的引物，分析高原湖泊肌尾科噬藻体g20基因多样性。

抚仙湖、滇池和星云湖都属于中国云南的高原淡水湖泊，由于所处地理位置的差异以及周围人类活动的不同，在对3个湖泊噬藻体g20基因序列多样性研究时发现，3个高原湖泊肌尾科噬藻体g20基因序列大部分与来自其他淡水湖泊、海洋生态系统的g20基因群集更为相似，与稻田水体中g20基因进化距离较远，可能存在一些海洋噬藻体与淡水噬藻体有共同的起源；而与其他淡水湖泊相比，云南高原湖泊肌尾科噬藻体g20基因组成存在一定差异(图4)。ZHONG等[13]在安纳西湖和布尔热湖2个高原湖泊的研究发现，噬藻体g20序列与日本稻田和大西洋萨加索海的噬藻体g20序列同源性较高。DORIGO等[14]以g20基因CPS1/CPS8为引物研究法国布尔热湖时，通过系统发育分析发现所获得的噬藻体g20基因序列部分与海洋g20基因序列关系较近，部分g20基因序列为淡水湖泊所特有。不同水域间噬藻体g20基因多样性存在着一定差异，各自都有独特的类群，这表明g20基因的分布与其存在的环境具有一定关系[15]。

不同水域环境中噬藻体g20基因组成存在差异，这与不同环境中噬藻体种类有关。从湖泊富营养化程度来看，抚仙湖属于贫营养化湖泊，滇池和星云湖属于富营养化湖泊，抚仙湖噬藻体g20基因序列表现出更为丰富的多样性，而地理位置相近的星云湖噬藻体g20基因序列多样性并没有抚仙湖显著，推测由于富营养化的问题，贫营养化的抚仙湖蓝藻种类较星云湖丰富，宿主多样性导致噬藻体g20基因多样性更为丰富。与星云湖同为富营养化湖泊的滇池噬藻体g20基因多样性也较为单一，表明噬藻体基因多样性与湖泊环境及其宿主多样性有很大关系。以g20为遗传标记对海洋水体的研究发现，其宿主与浮游病毒的基因多样性呈正相关[16]，水体中病毒与其宿主的丰度也呈正相关[17]，这说明抚仙湖蓝藻种类比星云湖丰富，导致抚仙湖噬藻体g20基因多样性较其他2个湖泊更为丰富。

相比秋、冬两季，抚仙湖、滇池和星云湖的g20基因序列多样性差异并不显著，可能是因为云南高原3个湖泊相距较近，且秋冬季湖泊温度差异不大，导致湖泊中蓝藻种群变化较小，噬藻体g20基因序列多样性差异并不显著。噬藻体g20基因的时空变化表明它们的宿主蓝藻群落也在湖泊中发生着时空变化。SANO等[18]报道了同一环境的海洋噬藻体可以感染不同环境中的宿主。WANG等[19]对于东北稻田噬藻体phoH基因独特性分布的研究表明，噬藻体不受地理分布的限制。后续研究中，了解噬藻体群落与蓝藻群落之间的联系是必不可少的。

综上所述，以g20基因作为分子标记，采用PCR-克隆测序技术，对云南高原湖泊g20基因遗传多样性进行研究发现，滇池、抚仙湖和星云湖水体中存在着丰富的肌尾科噬藻体g20基因序列，存在新的噬藻体g20基因；3个湖泊中肌尾科噬藻体g20基因类群与其他淡水湖泊、海洋水体g20基因类群进化距离较近，即亲缘关系较近，与稻田水体中g20基因亲缘关系较远。秋冬季肌尾科噬藻体g20基因遗传多样性不明显，贫营养状态的抚仙湖g20基因遗传多样性相对较为丰富。