赶黄草总黄酮对四氯化碳所致小鼠急性化学性肝损伤的保护作用

付满玲，九红，袁叶飞

（西南医科大学药学院，四川泸州 646000）

肝脏是人体最重要的代谢器官，承担着代谢、氧化、还原等重要的生理功能，肝脏疾病已成为危害人类健康的重要疾病之一[1]。肝损伤是各类肝病共有的一种病理状态，化学性肝损伤是临床中最为常见的肝损伤类型。化学性肝损伤主要包括环境毒物性肝损伤、酒精性肝损伤和药物性肝损伤[2]。随着工业发展、环境污染的加重，饮酒人群的增多以及药物的滥用，化学性肝损伤发病率越来越高，严重影响人们的生命健康。如何有效的预防和治疗化学性肝损伤，阻止其进一步恶性发展为脂肪肝、肝硬化、肝癌和肝功能衰竭等严重肝脏疾病，已成为医药及保健食品领域的研究热点。

赶黄草（Penthorum chinensePursh.）是虎耳草科扯根菜属植物扯根菜的干燥地上部分，主产于四川、贵州、湖南等地。赶黄草为药食同源植物，于2020年6月被国家卫健委正式批准为新食品原料。赶黄草性平、味苦、微辛、无毒，归肝、肾经，具有主治黄疸、经闭、水肿、跌打损伤等症。赶黄草有上千年的用药史和食用史，对于肝病治疗[3]，具有独特疗效，被誉为“神仙草”[4]。

赶黄草对化学性肝损伤具有保护作用[5-7]，但其功效成分尚未阐明。目前已从赶黄草中分离得到约120个化合物，其中黄酮类化合物大约为40个，黄酮类化合物是赶黄草的主要化学成分[8-10]；赶黄草总黄酮在赶黄草中的含量为3.92%，赶黄草总黄酮是赶黄草的主要活性部位[11]。项目组前期制备了纯度超过50%的赶黄草总黄酮（以乔松素计），赶黄草总黄酮主要由异槲皮苷、乔松素、槲皮素、山奈酚和芹菜素组成[11]（图1），其中乔松素、槲皮素、山奈酚和芹菜素为已报道的保护化学性肝损伤化合物[12-15]。据此我们推测赶黄草总黄酮可能对化学性肝损伤具有保护作用。

图1 赶黄草总黄酮高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography (HPLC) on total flavonoids of Penthorum chinense Pursh

四氯化碳（CCl4）是公认的复制肝损伤动物模型的化学物质[16]，其优点为造模时间短、方便可行、诱导的动物肝毒性特征与人类相似[17]。本试验建立CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型，分析小鼠肝脏指数、病理切片、血清和肝脏的生化指标，探讨赶黄草总黄酮对CCl4诱导的急性肝损伤的保护作用及可能机制，阐明赶黄草总黄酮是赶黄草保护化学性肝损伤的功效成分，为其开发为辅助保护化学性肝损伤的保健食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

赶黄草，采自四川古蔺县，经西南医科大学税丕先教授鉴定为虎耳草科植物扯根菜（Penthorum chinesePursh.）的干燥全草；赶黄草总黄酮（自制，纯度为50.34%，批号20200621），以含水乙醇加热回流提取赶黄草，并利用聚酰胺柱色谱纯化而得；联苯双酯滴丸（批号19j200607），万邦德制药有限公司；四氯化碳（CCl4，分析纯，批号01162305），上海泰坦化学有限公司；95%乙醇（分析纯，批号2019022201），成都市科隆化学品有限公司；橄榄油（批号692247659371），四川省青川县川珍实业有限公司；4%多聚甲醛（批号70081800），中国Biosharp公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒（批号1219051）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）试剂盒（批号0120051）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（批号0120091）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒（批号0720091），迈克生物股份有限公司；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，α，TNF-α）试剂盒（批号EK282/3-96）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒（批号EK206/3-96），联科生物；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（批号A003-1）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（批号A001-3），南京建成生物工程研究所；PBS磷酸盐缓冲液（0.01 M，pH 7.2~7.4，批号ZLI-9062），京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.2 动物

SPF级成年昆明小鼠，雄性，体重（20±2 g），购于西南医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK(川)2018-17)]。

1.1.3 主要仪器

EYELA OSB-2200旋转蒸发仪，东京理化公司；mini spin离心机，德国eppendorf公司；ME204E/02电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UPH-1-20L超纯水系统，四川优普超纯科技有限公司；7180全自动生化分析仪，日立公司；移液器，艾本德公司；HZ-9201K恒温摇床，华利达公司；LDZX-40BI高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；TD-5Z离心机，蜀科公司；TECAN酶标仪，瑞士SUNRISE公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、给药及处理

50只雄性昆明小鼠适应性饲养一周后，按体重随机分为正常组、模型组、联苯双酯滴丸阳性对照组（150 mg/kg）、赶黄草总黄酮高剂量组（800 mg/kg)和赶黄草总黄酮低剂量组（400 mg/kg)，每组10只。正常组和模型组每日灌胃给药（ig）等体积蒸馏水（0.2 mL/10 g），其余各组每日ig相应药物1次，连续21 d。末次给药1 h后，除正常组腹腔注射（ip）等体积蒸馏水外，其余各组均ip 1% CCl4橄榄油溶液10 mL/kg。禁食不禁水16 h，小鼠眼球取血，3000 r/min离心10 min，分离得到血清，小鼠脱臼处死后，采集肝脏组织，称量肝脏重量计算脏器系数，将肝脏组织分为两部分，一部分肝脏于-80 ℃冻存备用，另一部分用4%多聚甲醛固定。

1.2.2 生化指标检测

取各组小鼠血清上清液，按照试剂盒说明书进行操作，采用全自动生化仪测定ALT、AST、ALP和LDH水平；同时，各组取一定的肝组织，按1:9的比例进行肝组织匀浆，制备10%肝组织匀浆样本，取上清液用酶联免疫吸附法（ELISA）按照试剂盒进行操作，测定TNF-α、IL-6和MDA含量，以及SOD活力。

1.2.3 肝脏组织病理切片观察

取出固定于4%多聚甲醛的肝脏，进行石蜡包埋并切片，切片厚度约4 μm，采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色法），光学显微镜下观察肝脏组织病理学改变，比较各组小鼠肝脏组织损伤情况。

1.3 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，用单因素方差分析（ANOVA）进行差异性检验，p<0.05表示有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 赶黄草总黄酮对小鼠体重和肝脏系数的影响

正常时，动物肝脏系数比较稳定；动物染毒后，肝脏系数会发生改变。肝脏系数增加，表明肝脏充血、水肿或增生肥大等。由表1可知，模型组的肝脏系数为4.94%，较正常组4.49%上升了10.02%，具有极显著差异（p<0.01），表明模型组小鼠有明显的肝充血和肿胀情况，与肉眼观察基本一致；赶黄草总黄酮高剂量组和低剂量组的肝脏系数分别为4.31%和4.50%，较模型组4.94%分别下降12.75%和8.91%，且均具有显著差异（p<0.05），表明赶黄草总黄酮对四氯化碳所致小鼠肝充血和肝肿胀具有明显改善作用。

表1 赶黄草总黄酮对小鼠肝脏系数的影响Table 1 Effects of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on liver coefficient in mice (x±s, n=10)

2.2 赶黄草总黄酮对小鼠血清肝功能指标ALT、AST、ALP、LDH水平的影响

AST和ALT是检测肝功能最敏感的指标，其活性的高低反映了肝脏受损的程度[18]。正常状态时，AST与ALT存在于肝细胞浆；肝细胞受到损伤时，二者则会从肝脏渗漏到血液中，导致AST与ALT在血清中的浓度急剧上升。ALP、LDH也常用于肝脏疾病的诊断，当肝细胞发生损伤时值会升高，其可在一定范围内可反映生物体内肝细胞损伤程度。由表2可知，正常组小鼠血清ALT、AST、ALP和LDH分别为41.91、134.58、138.00和1078.00 IU/L，而模型组小鼠血清ALT、AST、ALP和LDH水平均显著升高，分别为330.89、1871.50、173.00和34931.00 IU/L，均具有统计学差异（p<0.05，p<0.01），表明CCl4对小鼠造成了急性肝损伤，造模成功；赶黄草总黄酮高剂量组的ALT、AST、ALP和LDH较模型组分别显著降低了86.01%（p<0.01）、91.03%（p<0.01）、25.50%（p<0.05）和95.54%（p<0.01），赶黄草总黄酮低剂量组的ALT、AST和LDH活性分别较模型组显著降低了76.06%（p<0.01）、84.91%（p<0.01）、93.87%（p<0.01）；赶黄草总黄酮高、低剂量组LDH分别为1556.90和2142.00 IU/L，较阳性药联苯双酯组23437.45 IU/L分别降低93.36%和90.86%，均具有极显著性（p<0.01）。上述表明赶黄草总黄酮对CCl4引起的小鼠血清ALT、AST、ALP和LDH升高具有拮抗作用，并且在拮抗ALP和LDH方面本试验发现赶黄草总黄酮（800，400 mg/kg）优于阳性药联苯双酯滴丸（150 mg/kg），表明赶黄草总黄酮对CCl4引起的化学性肝损伤具有很好的保护作用。

表2 赶黄草总黄酮对小鼠血清ALT、AST、LDH、LDH水平的影响Table 2 The effect of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on serum ALT, AST, LDH and LDH levels in mice (x±s, n=10)

2.3 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织中炎症因子TNF-α、IL-6水平的影响

肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等炎症因子的释放和浸润，会促使细胞凋亡坏死，引发炎症反应而导致肝损伤甚至肝纤维化[19,20]。由表3可知，模型组的TNF-α和IL-6水平分别为339.19和279.49 pg/mL，正常组分别为201.77和205.37 pg/mL，模型组较正常组均显著升高（p<0.01）；赶黄草总黄酮高剂量组的TNF-α为254.75 pg/mL，与模型组比较显著降低了24.89%（p<0.05）；赶黄草总黄酮高剂量组、低剂量组的IL-6活性分别为221.05和227.50 pg/mL，与模型组相比分别降低20.91%和18.60%，均具有显著性差异（p<0.05），表明赶黄草总黄酮可通过抑制TNF-α和IL-6活性而对CCl4引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用。

表3 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织中TNF-α、IL-6水平的情况Table 3 The effect of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on the levels of TNF- and IL-6 in the liver of mice (x±s,n=10)

2.4 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织中氧化应激指标SOD和MDA水平的影响

在CCl4刺激肝脏导致急性肝损伤过程中，机体内的氧化和抗氧化过程失衡从而激活氧化应激过程，产生的大量氧化中间产物诱导一系列的炎症反应，加剧疾病进展。当CCl4进入肝脏后产生大量的氧自由基，与细胞膜上的磷脂结合后会生成脂质过氧化物，最终形成丙二醛（MDA）引起细胞进一步损伤。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能清除CCl4生成的自由基，减少过氧化物对肝细胞的侵袭损害[21]。MDA作为脂质过氧化终产物，是反映组织损伤时出现过强氧化作用的指标之一，其活性越高，表明氧化活性越强，组织受损程度越大[18]。由表4可知，模型组小鼠肝组织中的SOD活力为122.78 U/mg，正常组为203.66 U/mg，模型组显著低于正常组（p<0.01）；模型组的MDA含量为181.48 U/mg，正常组为85.65 U/mg，模型组显著高于正常组（p<0.01），表明CCl4造模成功，也说明CCl4损伤肝脏后，机体内氧化和抗氧化失衡，清除自由基能力明显降低，导致SOD活性下降和脂质过氧化产物MDA增加。赶黄草总黄酮高、低剂量组小鼠肝脏组织SOD活力分别为181.99和174.63 U/mg，与模型组比较分别升高了48.22%和42.23%，均具有极显著性差异（p<0.01）；赶黄草总黄酮高、低剂量组小鼠肝脏组织 MDA含量分别为109.88和134.98 U/mg，与模型组比较分别降低了39.45%和25.62%，具有极显著或显著性差异（p<0.01，p<0.05），表明赶黄草总黄酮可能通过上调SOD活性，降低MDA含量来缓解氧化应激，从而改善CCl4诱导的小鼠肝损伤。

表4 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织中SOD、MDA活性的影响Table 4 The effect of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on SOD and MDA activities in the liver of mice (x±s,n=10)

2.5 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织病理变化的影响

2.5.1 大体肉眼观察

正常组小鼠肝脏外观呈红褐色，质软富有弹性；模型组小鼠肝脏颜色偏白，体积明显增大，有肿胀感；联苯双酯滴丸组、赶黄草总黄酮高剂量组、赶黄草总黄酮低剂量组肝脏状态有所改善，接近正常组。

2.5.2 肝脏组织HE染色光镜观察

肝脏病理学检查被认为是判断肝脏损伤的金标准[22]，小鼠肝组织病理检测结果如图2所示。正常组小鼠肝小叶结构完整清晰，以中央静脉为中心呈放射状排布，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态正常，无细胞坏死等病变，与王凯[23]等报道基本一致；模型组小鼠肝小叶结构模糊，肝细胞索排列紊乱，肝细胞正常结构消失出现片状坏死（1号箭头），有炎性细胞浸润小灶（2号箭头），残留的细胞胞体肿胀，出现空泡变性（蓝色箭头），胞质疏松淡然，表明CCl4引起了小鼠肝组织损伤，造模成功，与翟红月[24]等报道基本一致；联苯双酯组肝小叶结构尚模糊，肝细胞索排列紊乱，较多肝细胞胞质中有微小的空泡（3号箭头），细胞状态较模型组有所改善；赶黄草总黄酮高剂量组肝细胞索排列整齐，无炎性细胞，有少量空泡细胞（蓝色箭头），肝小叶结构和细胞形态基本正常较模型组改善状态较好；赶黄草总黄酮低剂量组肝细胞索排列尚整齐，肝小叶结构清晰，无炎性细胞，胞体略肿胀，有少量空泡细胞（蓝色箭头），较模型组有所改善，表明赶黄草总黄酮具有改善CCl4对肝脏的病理损伤。

图2 CCl4对小鼠肝组织病理变化的影响（HE染色，×200）Fig.2 Effects of CCl4 on pathological changes of liver tissues in mice

3 结论

赶黄草对化学性肝损伤具有保护作用，但其功效成分尚未阐明。项目组前期制备了纯度超过50%的赶黄草总黄酮，赶黄草总黄酮作为中药活性部位，具有功效成分富集、功效作用强的特点。本研究我们发现赶黄草总黄酮能有效降低CCl4所致肝损伤小鼠体内肝脏系数、血清肝功能相关指标酶（ALT、AST、ALP、LDH）和肝组织炎性因子（TNF-α、IL-6）水平，赶黄草总黄酮（800，400 mg/kg）在拮抗ALP和LDH方面优于阳性药联苯双酯滴丸（150 mg/kg）；赶黄草总黄酮能有效提高CCl4所致肝损伤小鼠肝脏中抗氧化物酶SOD活性，降低脂质过氧化物MDA含量，改善肝损伤病理状态。上述表明赶黄草总黄酮对四氯化碳所致急性化学性肝损伤具有较好的保护作用，作用机制可能与其抑制氧化应激反应及炎症反应有关。本试验阐明了赶黄草总黄酮是赶黄草保护化学性肝损伤的功效成分，为把赶黄草总黄酮开发为辅助保护化学性肝损伤的保健食品提供了依据。