卡帕藻对5-氟尿嘧啶所致肠粘膜损伤的保护作用

张青，高远，程枭杰，王志广，李春君，林碧音，唐庆娟

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003）（2.马来亚大学海洋与地球科学研究所，吉隆坡 50603）

化疗是一种治疗恶性肿瘤常用且有效的方法，但会对肠黏膜造成损伤，进而导致肠道屏障功能障碍。而氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一种抗代谢药物（化疗药物），是氟化嘧啶类抗肿瘤药[1]。它主要通过竞争性抑制胸苷酸合酶来抑制DNA合成，从而发挥作用。与5-FU相关的最明显的副作用包括粘膜炎、皮炎、心脏毒性和骨髓抑制[2]。另外，5-FU还会引起肝损伤、机体免疫功能和造血功能的低下等。5-FU临床使用时，可对肿瘤细胞有杀伤作用，同时对具有快速分化能力的小肠细胞也具有杀伤作用，使得肠粘膜屏障损伤是化疗的主要毒副作用[3,4]。5-FU诱导的肠粘膜改变有5个阶段，包括化学疗法介导的信使信号的产生和上调，通过炎性介质的信号传递以及粘膜损伤的放大、溃疡和最终愈合过程的开始[5,6]。研究还发现，促炎因子（例如TNF-α、IL-1β和IL-6）的合成与5-FU所致的肠粘膜屏障损伤的发展有关[7]。据统计，在化疗过程中50%~80%的患者患有肠粘膜屏障损伤，随后出现溃疡、腹泻和腹痛的临床表现[8]。这直接增加了内腔中病原体入侵的风险，削弱了患者消化和吸收营养的能力，降低了治疗功效并影响了患者的生活质量。如今，临床上常用药物治疗化疗诱发的肠粘膜屏障损伤，包括5-氨基水杨酸、米诺环素（Minocycline）以及中药复方制剂等[9]。而这些药物治疗效果并不显著且有一定的副作用。因此，有必要研究天然产物，将其活性功能应用于化疗所致肠粘膜屏障损伤中。

在过去的十年中，海藻由于丰富的生物活性，已被医药、食品和营养保健等多个领域关注。其中，卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）是一种重要经济红藻，“海燕窝”[10,11]。卡帕藻富含κ-卡拉胶、多酚、类黄酮以及花青素等多种海洋天然活性成分[12-14]。同时，研究表明卡帕藻或其提取物具有极好的抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎和促进人体肠道健康等功效，在功能性食品、保健食品及药品的开发和应用方面具有巨大潜力[15,16]。通常，从海洋中采集的海藻藻体中含有大量的水份，在用于营养研究或食品加工之前要先进行干燥。同时，干燥也是海藻收获后最常用的加工贮藏方法。但是，植物材料干燥过程中去除水分的同时会发生明显的变形，从而使植物基质及其细胞壁和膜的功能退化，进而导致抗氧化化合物或多或少地暴露在氧化反应中[17]。已有文献证明，不同干燥方式会影响卡帕藻的活性成分及其功能[17]。Ling等研究表明晾干条件下卡帕藻中的总酚、总黄酮、总花青素及总类胡萝卜素含量均高于晒干条件下，其抗氧化活性也优于晒干卡帕藻[18]。然而，目前研究都集中于体外的抗氧化研究，缺乏体内的活性研究比较。

因此，基于目前的研究现状，本研究以两种干燥加工下的卡帕藻为受试物，将其添加到标准饲料中，通过腹腔注射5-FU建立小鼠肠粘膜损伤模型，记录和测定卡帕藻对小鼠表观指标、空肠组织病理学及血清中炎症因子的影响，探讨两种干燥加工下卡帕藻对5-FU所致肠黏膜损伤的保护作用，明确其具有改善化疗患者的生活质量的潜力，为卡帕藻的加工及深入开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性Balb/c小鼠（15~21 g，6周龄，SPF级），购于北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（浙）2019-0001）。将小鼠圈养在环境可控的条件下（温度为23±2 ℃；相对湿度为50%±10%；光照/黑暗周期为12 h），并且可以自由使用经认证的饲料和清洁水（矿泉水）。所有的动物实验均按照中华人民共和国的道德准则和法规进行，并得到中国海洋大学食品科学与工程学院实验动物伦理委员会的批准。

卡帕藻（K. alvarezii），马来西亚仙本那地区，苏拉威西海域；5-氨基水杨酸、5-氟尿嘧啶，上海源叶生物科技有限公司；AIN93标准饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；TNF-α酶联免疫吸附试剂盒、IL-10酶联免疫吸附试剂盒，卡尔文生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

食品研磨机，小熊电器；超低温冰箱（DW-86L486），青岛海尔特种电器有限公司；电子天平（CP224C），奥豪斯仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机（NEOFUGE 23R），上海力申科学仪器有限公司；微孔板恒温震荡器（B E-9008），上海坤诚科学仪器有限公司；酶标仪（SPARK 10M），帝肯（上海）贸易有限公司；电动荧光显微镜（NIKON/Ni-E），日本尼康公司。

1.3 实验设计

1.3.1 动物饲料

先将收获的新鲜卡帕藻分为两组，第一组是将海藻放入透明的塑料袋中，在阳光下放置到卡帕藻颜色变成白色为止（2~3 d），然后从透明的塑料袋中取出，经清洗干净后再在阳光下干燥3~4 d，此组记为晒干组；第二组是直接将收获的卡帕藻悬挂起来，直到它们变为紫色，风吹日晒下干燥3~4 d，将其记为晾干组。之后，将经干燥处理的新鲜卡帕藻在-60 ℃冷冻干燥48 h后，使用食品研磨机将其磨碎，并过80目筛。最后，将卡帕藻粉末保存在-20 ℃以备制作动物饲料使用。

动物饲料选自南通特洛菲饲料科技有限公司的AIN93标准饲料（产品代码LAD3001G）。根据美国FDA标准规定饲料中受试物的添加量不得超过5%，以不影响正常饮食结构为目的，将所得到的两种干燥条件的卡帕藻粉末分别以3%的比例分量拌入各自标准饲料中，参照JAWAD等[19]报道的方法，将5-氨基水杨酸（作为阳性对照）以0.005%的比例分量拌入标准饲料中，最终饲料的组别见表1。

表1 饲料组别与标签Table 1 Feed group and label

1.3.2 动物分组与给药

将35只雄性Balb/c小鼠适应性喂养一周后，按照体重随机分成5组（n=7）：正常组（N）、模型组（M）、阳性对照组（5-ASA）、晒干卡帕藻组（SKA）和晾干卡帕藻组（AKA）。从第0 d起，M组、5-ASA组、SKA组和AKA组的小鼠腹腔注射5-FU（50 mg/kg，溶于生理盐水）诱导肠粘膜损伤，而N组的小鼠腹腔注射等体积灭菌生理盐水，连续3 d。同时，各组小鼠喂食不同的饲料，给予N组和M组小鼠标准饲料（LAD3001 G），而其他三组的饲料分别为5-ASA、SKA、和AKA，持续7 d（见图1及表2）。小鼠在整个实验期间（7 d）饲养在专门动物饲养笼内，每日给予小鼠正常饮食并维持小鼠生活的卫生环境。在实验过程中，每天记录小鼠的体重和摄食量。实验结束时（第8 d）麻醉小鼠并快速摘眼球取血，颈椎脱臼处死。快速分离空肠，取出相应脏器称重后放于液氮速冻，再放入-80 ℃冰箱保存备用。

表2 小鼠分组及给药情况Table 2 Grouping and administration of mice

图1 实验流程图Fig.1 Experimental flowchart

1.3.3 一般情况的观察

实验期间记录各组小鼠体重、摄食量，观察各组小鼠食欲、毛发及其整体状态。实验结束后计算小鼠体重增长指数和免疫器官指数。

1.3.4 组织病理学分析

为了进行组织病理学检查，将小鼠1 cm空肠段浸泡于4%多聚甲醛中，固定48 h以上后，每组取3只小鼠的空肠切片，进行苏木精-伊红染色（hematoxylineosin staining，HE）。之后，使用电动荧光显微镜在200倍下观察组织病理切片。每张照片选取5个视野统计空肠绒毛长度（villus）、隐窝深度（crypt），并计算绒毛长度/隐窝深度的比值（villus/crypt，V/C值）。

1.3.5 血清炎症因子测定

小鼠处死后，将血液于4 ℃、3500 r/min条件下离心15 min，TNF-α和IL-10的检测按照酶联免疫法（ELISA）试剂盒说明书操作进行。

1.4 实验数据处理与统计

实验数据均以（Mean±SEM）呈现，制图软件为GraphpadPrism8，统计学分析软件为SPSS 20。用单因素方差分析方法（One-Way ANOVA）分析，同时进行LSD组间比较。p<0.05视为具有统计学显著差异，p<0.01视为具有统计学极显著差异。

2 结果与讨论

2.1 卡帕藻对小鼠基本情况的影响

整个实验期间观察到，N组小鼠表现出正常的昼夜节律、没有痛苦症状、绒毛正常且精神状态良好。同时，观察到注射5-FU的M组、5-ASA组、SKA组和AKA组小鼠在白天表现的异常活跃，随后出现活动减少、绒毛松弛以及背部弓形，而在第5 d得到好转，昼夜节律逐渐恢复正常。这与ATIQ等的研究一致，观察到注射5-FU的小鼠出现驼背、耸肩和毛发松弛等现象[20]。

2.2 卡帕藻对小鼠体重的影响

在研究广藿香醇对5-FU所致肠粘膜损伤的保护作用中发现5-FU会导致大鼠体重的降低，随后第6天体重开始恢复[21]。图2a表明N组小鼠在实验期间保持稳定增长，M组、5-ASA组、SKA组和AKA组小鼠在腹腔注射5-FU后第1 d体重出现下降，之后随着腹腔注射结束和实验时间的延长，在第5 d各组小鼠体重开始升高。至实验结束M组体重明显低于N组（p<0.01），5-ASA组、SKA组和AKA组体重略高于M组。通过图2b发现M组（-7.50%）的体重增长率低于N组（8.32%），具有显著性差异（p<0.01），而5-ASA组（-3.30%）、SKA组（-6.19%）和AKA组（-5.09%）比M组的体重增长率略高。而分析第三天小鼠体重发现（图2c），M组（15.75 g）体重明显低于N组（21.88 g）（p<0.01），5-ASA组（16.85 g）、SKA组（16.83 g）和AKA组（16.76 g）体重明显高于M组。结果表明，卡帕藻对5-FU所致肠黏膜损伤小鼠体重的降低具有抑制作用，且第3 d时，卡帕藻可显著抑制小鼠体重的降低。

图2 小鼠体重变化Fig.2 Changes in mouse body weight

2.3 卡帕藻对小鼠摄食量的影响

在砂仁挥发油对5-FU诱导肠粘膜炎的保护作用中发现5-FU会导致大鼠摄食量的降低，在造模结束后，模型组和各受试物组的摄食量开始恢复[22]。从图3可以看到，N组在实验期间平均摄食量在3.50 g左右，基本保持不变。M组、5-ASA组、SKA组和AKA组小鼠在腹腔注射5-FU后第1 d出现摄食量低于N组，之后随着腹腔注射结束和实验时间的延长，M组、5-ASA组、SKA组和AKA组小鼠摄食量开始逐渐升高与N组达到一致。接着，分析第三天小鼠摄食量发现（见图3b），M组摄食量（1.54 g）显著低于N组（3.51 g）（p<0.01），而5-ASA组（2.15 g）、SKA组（2.18 g）和AKA组（2.19 g）摄食量明显高于M组。结果表明，卡帕藻对5-FU所致肠粘膜损伤小鼠摄食量的降低具有抑制作用，且第3 d时，卡帕藻可显著抑制小鼠摄食量的降低。

图3 小鼠摄食量变化Fig.3 Changes in food intake of mice

2.4 卡帕藻对小鼠免疫器官的影响

5-FU是一种细胞毒性药物，持续使用可以靶向快速的分裂细胞，使具有快速增殖潜能的正常细胞（如骨髓）和胃肠道粘膜细胞与癌细胞一样，受到损害，进而造成肠粘膜屏障损伤。而胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其质量与所含的免疫细胞数量及免疫功能密切相关，脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱[23]。由图4及表3所示，与N组小鼠相比，M组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均降低，呈现极显著性差异（p<0.01）。与M组小鼠相比，各受试物组小鼠的免疫器官指数有所改善，但无显著性差异。结果说明，注射5-FU会使小鼠免疫器官受损，免疫力降低，本实验造模成功，而卡帕藻可改善免疫器官受损情况，进而缓解5-FU的细胞毒性。

表3 小鼠免疫器官指数Table 3 Mouse immune organ index

图4 小鼠免疫器官指数Fig.4 Mouse immune organ index

2.5 卡帕藻对小鼠空肠组织病理学的影响

形态学分析表明，注射5-FU会导致小肠巨大的组织学损伤，包括绒毛长度缩短、绒毛结构丧失、隐窝变形以及炎性细胞浸润等[24]。组织学分析显示（见图5a），N组小鼠的空肠无组织形态变化，绒毛与完整的隐窝对齐，细长且排列紧密，肠粘膜结构清晰。观察到M组空肠黏膜明显的组织病理学改变，引起肠粘膜结构破坏，表现为隐窝结构明显丧失，严重萎缩的迹象，绒毛的缩短和杂乱无章，大量炎性细胞浸润，黏膜和囊肿均出现空泡和水肿，这与YU等研究一致[25]。而各受试物组可显着逆转5-FU所致的空肠组织病理学改变，表现为绒毛细长，排列紧密，肠粘膜结构相对完整。

图5 小鼠空肠形态学结构Fig.5 Morphological structure of mouse jejunum

小肠的隐窝和绒毛功能单元是肠上皮持续更新的基础，并参与消化吸收功能，进而维持肠粘膜功能的正常[26]。对空肠的绒毛长度和隐窝深度统计分析发现（见图5b和图5c），与N组（360.22 μm）相比，M组（252.09 μm）绒毛长度显著降低；而5-ASA组（332.58 μm）、SKA组（334.44 μm）和AKA组（350.75 μm）与M组相比，绒毛长度显著增加（p<0.01）。隐窝深度也表现为同样的趋势。V/C值表明，与N组（6.40）相比，M组（5.12）小鼠的V/C值明显下降，而5-ASA组（6.39）和AKA组（6.35）的V/C值显著优于M组（p<0.05）。这与JAWAD等的研究结果一致，经5-FU处理的小鼠在小肠中表现出明显的绒毛长度和隐窝深度改变，而阳性组和皂苷A组可以减弱这种现象[19]。以上发现表明，卡帕藻显著保护了5-FU所致小鼠肠粘膜损伤，其中晾干卡帕藻具有更好的保护作用。

2.6 卡帕藻对小鼠血清炎症因子的影响

炎性标志物的过量产生主要与肠粘膜屏障损伤有关，5-FU诱发小鼠肠粘膜屏障损伤后，促炎因子表达显着增加，抗炎因子显著降低[27]。由图6所示，检测小鼠血清中炎症因子，发现M组小鼠有炎症反应。其中，AKA组（470.43 pg/mL）与M组（580.69 pg/mL）相比，显著降低了促炎因子TNF-α的含量（p<0.05），提高了抗炎因子IL-10的含量。ZHANG等的研究也发现，经5-FU处理的小鼠血清检测发现促炎因子TNF-α升高和抗炎因子IL-10降低，而清结扶正颗粒组可以显著改变这一现象[28]。此外，本研究还发现AKA组与SKA组相比，AKA组可显著降低TNF-α含量和升高IL-10含量。结果表明，卡帕藻能够降低小鼠血清TNF-α的释放和提高IL-10的释放，进而对肠粘膜损伤起到保护作用，其中晾干卡帕藻可更好地保护卡帕藻的这一活性。

图6 小鼠血清炎症因子指标Fig.6 Mouse serum inflammatory factor indicators

本研究表明，卡帕藻对由5-FU引起的胃肠道毒性具有强大的预防潜力，可有效改善相关的临床症状。这可能是卡帕藻含有多糖、多酚以及黄酮等多种活性物质，其中的一种成分或是几种成分协同发挥了抗炎、抗氧化、抗癌、提高免疫力及调节肠道菌群等多种功效[29-31]。此外，研究证明不同干燥方式下的卡帕藻对5-FU引起肠粘膜损伤的保护作用具有不同的影响。其中，晾干卡帕藻的活性更好。这可能是因为不同干燥条件对生物活性化合物的含量、活性和生物利用度都有不同程度的影响。Tomaino等研究表明干燥过程通常会导致植物原料中天然抗氧化剂的消耗[32]。这是因为温度，过长干燥时间，阳光中的紫外线以及干燥过程中样品的脱水可能会破坏某些活性化合物，包括抗坏血酸、生育酚和类胡萝卜素等，进而导致植物化学含量和抗氧化活性受到不同程度的影响[33]。而本研究中的干燥条件在很大程度上取决于天气和白天的时间，这导致了干燥时间长（在阳光直射下需要3~4 d），干燥速度慢，延长了海藻在空气中的暴露时间，进而不同程度的影响了活性成分的氧化并降低了其活性。研究已证明，晾干条件下卡帕藻中的总酚（41.33>26.67 mg没食子酸/100 g）、总黄酮（16.17>9.83 mg/儿茶素100 g）、总花青素（1.05>0.53 mg氰化物-3-葡萄糖苷/g）及总类胡萝卜素（0.10>0.03 mgβ-胡萝卜素/g）含量均高于晒干条件下，其清除2-2-二苯基-1-吡啶基肼基能力的IC50值（22.93>48.73 mg/mL）、清除2,2-叠氮基双-（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）能力（0.34>0.20 mg抗坏血酸/g）等也高于晒干卡帕藻[18]。Vairappan等研究显示晾干条件下卡帕藻中的卡拉胶含量（58.3>42.8%）和质量（粘度57.8>42.4 cPs，凝胶强度1424.6>898.2 g/cm2）均优于晒干条件下的卡拉胶[17]。因此，与晒干相比，晾干干燥可更好的保护卡帕藻的活性，在改善化疗所致肠粘膜损伤中表现出更强的健肠功效。

3 结论

本研究通过5-FU构建肠粘膜损伤模型来比较研究两种干燥方式下卡帕藻的保护作用。观察到两种干燥方式下卡帕藻均可抑制5-FU导致的小鼠体重和摄食量的降低。对免疫器官指数的统计分析也发现卡帕藻可改善胸腺和脾脏免受损伤，进而减轻5-FU对机体造成的细胞毒性。通过组织学分析，卡帕藻的干预可改善5-FU引起的组织病理学变化和显著上调绒毛长度。另外，与模型组相比，晾干卡帕藻可显著上调V/C值，更好地保护粘膜的结构和组织。在炎症方面，施用5-FU后，在血清中观察到促炎因子（TNF-α）升高和抗炎因子（IL-10）降低，而晾干卡帕藻可显著逆转这一现象，支持了卡帕藻的干预抑制了肠粘膜损伤模型中炎性介质的产生。此外，研究结果还表明，不同干燥方式影响了卡帕藻活性的发挥，通过V/C值和血清炎症因子可分析到，晾干卡帕藻的效果优于晒干卡帕藻。综上所述，卡帕藻干预可以通过缓解相关的临床症状、减缓5-FU的细胞毒性、改善肠道形态学损伤和调节炎症稳态来预防5-FU诱导的肠粘膜损伤，其中，晾干卡帕藻的效果优于晒干卡帕藻。这说明卡帕藻可作为理想的功能性食品原料，有望为卡帕藻的精深加工提供科技支撑。