茯苓不同溶剂提取物改善小鼠睡眠作用的比较

孙梦娜，叶辉宇，李强明，张玉英，杨思林，魏春厅，罗建平

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230601）

（2.安徽省华信生物药业股份有限公司，安徽界首 236500）

失眠症是最常见的心理疾病之一，其特征是难以启动或维持睡眠，并伴有诸如清醒时的烦躁或疲劳等症状[1]。与其他疾病相比，失眠综合症非常普遍。据报道，一般人群中有6%至50%的人有失眠症状，10%至15%的人曾忍受过失眠症引起的疼痛。在中国，失眠的总患病率为15%，约20.7亿人存在睡眠问题[2,3]。然而，常见的催眠药虽然有较好的治疗失眠症的作用，但是会出现很多明显的副作用，尤其是苯二氮卓类药物，使用它们会引起运动和认知障碍等副作用[4,5]。面对这些局限，人们倾向于寻求天然药物来治疗或缓解失眠症状，中药是一种天然药物，并且历代医书记载了大量具有改善睡眠功效的中药单味方药，为治疗失眠提供了可借鉴的经验[6]。

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf的干燥菌核[7]，多寄生于松科植物赤松或马尾松等树根上，是药食两用、临床运用最多的大宗和传统中药材，有“十方九苓”之说[8]，具有利水渗湿、健脾宁心等功效[9]。《神农本草经》将茯苓列为上品药材，认为它“久服安魂养神，不饥延年”[10]；《本草备要》指出茯苓可以“宁心益气，调营理卫，定魄安魂”[11]。民间常用茯苓调理睡眠[12]，传统助眠中药复方，如归脾汤[13]、天王补心丸[14]、安神利眠汤[15]、疏肝健脾安神汤[16]等都含有茯苓。

现代研究表明，茯苓具有免疫调节[17]、抗炎、抗氧化[18]、镇静与催眠[19]等生物活性，其主要活性成分为三萜类和多糖类化合物[6]。药理学实验证明了茯苓不同提取成分都具有镇静、催眠作用[20,21]，但是研究报道的动物模型、提取方法、给药剂量和生药来源各不相同，因此无法对茯苓不同成分在改善睡眠作用的强弱方面进行直接比较，进而制约了茯苓中有助于改善睡眠的功能因子的开发与利用。本研究以同一来源的茯苓为原料，基于相同生药剂量，分别提取茯苓水提物、醇提物和多糖，运用相同动物模型对三种提取物的改善睡眠作用进行比较，以期为合理开发和有效利用茯苓中改善睡眠的功能因子提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

茯苓粉末（过100目筛）购于江苏滨海宏本堂商贸有限公司；戊巴比妥钠、巴比妥钠（≥99%）均购于北京华业寰宇化工有限公司；罗通定片购于四川迪菲特药业有限公司；五羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）和多巴胺（DA）酶联免疫吸附（ELSIA）试剂盒均购于上海泽宇生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠（纯度为98%）、乙醇（纯度为95%）购于上海国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

W-205数控恒温水浴锅，上海申胜生物技术有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机，北京博康实验仪器有限公司；CT15RT高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；XT5118-OV140恒温干燥箱，杭州雪中炭恒温技术有限公司。

1.3 实验动物

ICR健康雄性小鼠320只，2~3月龄，体质量18~22 g，饲养于SPF级动物房（温度24±2 ℃，相对湿度50%~60%，明暗交替12 h），由山东济南朋越繁育有限公司提供，动物许可证号为SCXK（鲁）2014-0007。

1.4 实验方法

1.4.1 茯苓不同溶剂提取物的制备

水提物的制备[22]：称取适量茯苓粉末，按照1:30的料液比加入双蒸水，90 ℃水浴浸提2 h，共2次，将所得浸提液抽滤，合并滤液，65 ℃减压浓缩，冷冻干燥得到茯苓水提物（提取率为2.82%±0.25%）。

醇提物的制备[23]：称取适量茯苓粉末，按照1:30的料液比加入95%乙醇，60 ℃水浴浸提2 h，共2次，药渣60 ℃干燥备用，将所得醇提液抽滤，合并滤液，65 ℃减压浓缩，60 ℃干燥至无醇味，得到茯苓醇提物（得率为2.52%±0.17%）。

多糖的制备[24]：称取适量制备醇提物的干药渣，按照1:30的料液比加入双蒸水，90 ℃浸提2 h，共2次，将所得浸提液抽滤，合并滤液，65 ℃减压浓缩，在4 ℃下用终浓度为80%的乙醇醇沉2次每次24 h，冷冻干燥得到茯苓多糖（得率为0.39%±0.09%）。

1.4.2 实验分组、给药方法和剂量设置

参照文献[25,26]，本实验包括直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验4部分，其中直接睡眠实验和小鼠脑组织中5-HT、GABA、DA含量测定实验使用同一批动物。每个实验各80只小鼠，小鼠适应性喂养一周后，随机分为8组（n=10），分别为空白对照组（0.5%羧甲基纤维素钠）、阳性组（罗通定片，15 mg/kg）、水提物高剂量和低剂量组、醇提物高剂量和低剂量组以及多糖高剂量和低剂量组。以《中华人民共和国药典（2020版）一部》中茯苓的人体（60 kg）推荐摄入量（9~15 g/d）中值（12 g/d）的10倍、20倍为依据[1]，结合茯苓不同溶剂提取物的提取率，确定水提物低剂量和高剂量组给药浓度为56.4 mg/kg和112.7 mg/kg，醇提物低剂量和高剂量组给药浓度为50.4 mg/kg和100.8 mg/kg，多糖低剂量和高剂量组给药浓度为7.8 mg/kg和15.6 mg/kg。茯苓不同溶剂提取物和阳性组药物的溶剂均为0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每组小鼠按照10 mL/kg剂量灌胃，连续灌胃30 d，观察各组小鼠体重变化及睡眠情况。

1.4.3 小鼠体重及脏器指数测定

实验前后，称取小鼠体重，观察各组小鼠实验前后体重变化。实验结束后，用二氧化碳处死小鼠，解剖脏器，计算小鼠脏器指数。小鼠脏器指数计算公式：脏器指数=脏器重量（mg）/小鼠体重（g）。

1.4.4 直接睡眠实验

小鼠连续灌胃30 d，末次给药15 min后观察各组小鼠在60 min内入睡只数。睡眠以翻正反射消失为指标，即当小鼠置于背卧式时，超过1 min不能翻正者即认为进入睡眠。

1.4.5 延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间实验

小鼠连续灌胃30 d，末次给药15 min后，各组小鼠腹腔注射经预实验确定剂量为38 mg/kg的戊巴比妥钠溶液，注射量为0.2 mL/20 g，以翻正反射消失1 min以上为入睡判断标准，记录各组小鼠延长戊巴比妥钠睡眠时间。

1.4.6 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

小鼠连续灌胃30 d，末次给药15 min后，各组小鼠腹腔注射经预实验确定剂量为24 mg/kg的戊巴比妥钠溶液，注射量为0.2 mL/20 g，以翻正反射消失1 min以上作为入睡指标，记录各组小鼠入睡只数及入睡时间。

1.4.7 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

小鼠连续灌胃30 d，末次给药15 min后，各组小鼠腹腔注射经预实验确定剂量为230 mg/kg的巴比妥钠，注射量为0.2 mL/20 g。以翻正反射消失1 min以上作为入睡指标，记录各组小鼠的睡眠潜伏期。

1.4.8 小鼠脑组织中5-HT、GABA、DA含量的测定

灌胃30 d后，小鼠禁食一天，用二氧化碳处死小鼠，迅速取出脑组织，冰浴匀浆，4 ℃、8000 r/min离心，取上清，采用ELISA试剂盒法测定5-HT、GABA、DA含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0进行统计分析，x±SD表示数据，以单因素方差分析（ANOVA）进行差异显著性检验，p<0.05具有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂提取物对小鼠体重及脏器指数的影响

动物体重和脏器指数分析显示，与空白对照组相比，茯苓水提物、醇提物、多糖等三种提取物不同剂量对小鼠体重无明显影响（表1），各组小鼠体重增长趋势一致，皮毛有光泽，饮食、活动正常，且肺、肝、脾、肾和胸腺的脏器指数均无统计学差异（表2），表明茯苓不同溶剂提取物在本试验设计剂量下对小鼠正常生长无影响（p>0.05）。

表1 不同溶剂提取物对小鼠体重的影响Table 1 Effects of different extracts on body weight in mice (±sd, n=10)

表1 不同溶剂提取物对小鼠体重的影响Table 1 Effects of different extracts on body weight in mice (±sd, n=10)

注：不同字母标注表示在p<0.05水平差异上显著。下表同。

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表2 不同溶剂提取物对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of different extracts on viscera index of mice (±sd, n=10)

表2 不同溶剂提取物对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of different extracts on viscera index of mice (±sd, n=10)

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2.2 直接睡眠实验

小鼠连续灌胃不同溶剂提取物30 d，在末次给药60 min内观察小鼠睡眠情况，各组小鼠均未出现翻正反射消失，说明茯苓不同溶剂提取物对小鼠无直接睡眠作用。

2.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

小鼠连续灌胃不同溶剂提取物30 d，在末次给药15 min后，腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为38 mg/kg，注射量为0.2 mL/20 g），记录各组小鼠睡眠时间。如表3所示，阳性组小鼠睡眠时间最长，其后依次为水提物高剂量组、醇提物高剂量组、多糖高剂量组、水提物低剂量组、醇提物低剂量组和多糖低剂量组。与空白对照组相比，水提物高剂量组、醇提物高剂量组、多糖高剂量组、水提物低剂量组和醇提物低剂量组均能显著延长小鼠睡眠时间（p<0.05），小鼠睡眠时间与空白对照组相比分别延长了44.02%、26.83%、23.71%、21.58%和15.91%，以水提物高剂量组效果最佳（p<0.01），而多糖低剂量组对延长小鼠睡眠时间的影响不显著（p>0.05）。徐煜彬等的研究也表明了生药42.8 g/kg茯苓水煎液可显著延长阈上剂量戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间[19]。Shah等报道茯苓酸在剂量分别为3 mg/kg、5 mg/kg时可以延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间[27]。赵天国采用协同戊巴比妥实验研究茯苓多糖对小鼠睡眠的改善作用，结果显示茯苓多糖低[1.9 g/（kg∙BW∙d）]、中[3.61 g/（kg∙BW∙d）]、高[5.80 g/（kg∙BW∙d）]剂量均具有显著延长睡眠时间的作用，睡眠时间分别延长了55.7 min、63.2 min、73.2 min，其作用效果呈剂量依赖性[28]。

表3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验Table 3 Prolong the sleep time of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

表3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验Table 3 Prolong the sleep time of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

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2.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

小鼠连续灌胃不同溶剂提取物30 d，在末次给药15 min后，腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为24 mg/kg，注射量为0.2 mL/20 g），记录各组小鼠睡眠发生率。如表4所示，阳性组睡眠发生率最高，其后依次为水提物高剂量组、醇提物高剂量组、多糖高剂量组、水提物低剂量组、醇提物低剂量组和多糖低剂量组。与空白对照组相比，水提物高剂量组能显著提高小鼠的睡眠发生率（p<0.05），其他各组虽然能提高小鼠睡眠发生率，但是作用效果不显著（p>0.05）。游秋云等[21]、李明月等[29]采用戊巴比妥钠协同催眠实验也证明了茯苓水提物能明显增加小鼠睡眠时间、提高小鼠入睡率，表现出良好的镇静催眠作用。

表4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验Table 4 Subthreshold hypnosis of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

表4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验Table 4 Subthreshold hypnosis of pentobarbital sodium (±sd,n=10)

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2.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

小鼠连续灌胃不同溶剂提取物30 d，在末次给药15 min后，腹腔注射巴比妥钠溶液（剂量为230 mg/kg，注射量为0.2 mL/20 g），记录各组小鼠睡眠潜伏期的变化。如表5所示，阳性组小鼠睡眠潜伏期最短，其后依次为水提物高剂量组、醇提物高剂量组、多糖高剂量组、水提物低剂量组、醇提物低剂量组和多糖低剂量。与空白对照组相比，水提物高剂量组、醇提物高剂量组、多糖高剂量组和水提物低剂量组均能显著缩短小鼠进入睡眠的时间（p<0.05），小鼠睡眠潜伏期比空白对照组分别缩短了26.9%、19.3%、11.5%和8.6%，以水提物高剂量组效果最佳，而醇提物低剂量组和多糖低剂量对小鼠睡眠潜伏期的影响不明显。本实验结合以上两个实验结果表明，茯苓不同溶剂提取物改善睡眠作用效果的不同与其所含主要成分不同有关。现代化学分析表明，茯苓水提物中包含茯苓多糖和茯苓酸，茯苓醇提物主要成分为茯苓三萜，且茯苓酸属于茯苓三萜类物质[8,30]。上述实验表明，水提物高剂量组改善小鼠睡眠作用的最佳效果可能与水提物所含有的茯苓酸和多糖的协同作用有关。

表5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验Table 5 Sodium barbiturate sleep latency test (±sd, n=10)

表5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验Table 5 Sodium barbiturate sleep latency test (±sd, n=10)

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2.6 茯苓不同溶剂提取物对小鼠脑组织中5-HT、GABA、DA含量的影响

研究发现，安神类中药起镇静催眠作用机制与睡眠相关的神经递质和睡眠因子有密切关系[6]。GABA是一种抑制性神经递质，它的镇静催眠作用主要是通过其与GABA受体（GABAA）特异性结合而实现的[31]。5-HT是参与睡眠调节作用重要的单胺类神经递质，脑内5-HT含量减少会导致动物失眠。DA是一种与睡眠调节相关的代谢产物，研究发现，动物脑内DA神经元兴奋会导致警觉性增加、睡眠减少[32]。因此，脑组织中GABA、5-HT与DA含量的变化能一定程度上反映小鼠睡眠质量。由表6可知，阳性组小鼠脑组织中5-HT、GABA含量最高（p<0.01），DA含量最低（p<0.01）；与空白对照组相比，水提物高剂量和低剂量组、醇提物高剂量组和多糖高剂量组小鼠脑组织中5-HT、GABA含量表现出不同程度增加，DA含量不同程度降低（p<0.05）。其中水提物高剂量组对小鼠脑组织的5-HT、GABA、DA含量影响最为显著（p<0.05）。

表6 各组小鼠脑组织中5-HT、GABA、DA的变化比较Table 6 Comparison of changes in 5-HT,GABA and DA in each group of mice brain (±sd, n=10)

表6 各组小鼠脑组织中5-HT、GABA、DA的变化比较Table 6 Comparison of changes in 5-HT,GABA and DA in each group of mice brain (±sd, n=10)

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3 结论

本研究结果显示，茯苓不同溶剂提取物对小鼠正常生长无影响；且能不同程度地改善小鼠睡眠情况，增加小鼠睡眠发生率，延长睡眠时间；升高脑组织中GABA与5-HT含量、降低DA含量。与空白对照组相比，水提物高剂量组效果最佳，其后是醇提物高剂量组、多糖高剂量组、水提物低剂量组、醇提物低剂量组（p<0.05），而多糖低剂量组效果不明显。茯苓不同溶剂提取物主要成分不同，因此发挥助睡眠作用效果不同。茯苓水提物助睡眠作用较强，并且多糖是水提物的主要活性成分，说明水提物中多糖发挥主要作用，不过茯苓水提物改善睡眠的作用机理可能与茯苓多糖和茯苓酸的协同作用有关。其作用机制可能是通过调节小鼠脑中的5-HT、GABA、DA含量来发挥改善睡眠的作用。但茯苓的使用应统筹考虑醇提物和水提物的合理配比来达到最佳的助睡眠功效，这需要进一步探索和研究。