血管内皮生长因子和促血管生成素2对甲状腺乳头状癌及颈部淋巴结转移的诊断价值

刘美莲 苏法铭 李晓玲 彭晓霞 陈晓铭

广东医科大学附属医院1肿瘤中心，2内分泌科，3病理科（广东湛江524023）

甲状腺乳头状癌（thyroid papillary carcinoma，PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤之一，大约占甲状腺恶性肿瘤的89.4%［1］，近年来其发病率呈逐年上升趋势［2］。随着人们生活方式的改变，PTC 有低龄化的趋势，虽然PTC 相比其他恶性肿瘤的预后一般较好［3］，但PTC 并发颈部淋巴结转移依然会给患者带来不良的预后，同时有研究表明年龄较小的PTC 患者比年龄较大的PTC 患者在并发颈部淋巴结转移上更具易感性［4］。合并颈部淋巴结转移为其不良预后因素，为患者的长期生存带来了极大的威胁。因此，临床上积极探索PTC 及其并发颈部淋巴结转移的分子生物学机制，寻找早期诊断及不良预后的分子标记物，有助于为临床医师早期发现和诊断疾病，并及时制定积极治疗策略提供有力证据，对于提升PTC 的总体治愈率具有极其重要的意义。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和促血管生成素2（angiopoietins-2，Ang-2）通过相应的信号通路相互影响［5］，在促进肿瘤血管生成及促进淋巴结转移上可能存在协同作用，目前VEGF 和Ang-2 在PTC中的研究仅有少量文献报道，且结论不一致。通过检测上述分子标志物表达，分析其对PTC 及其并发颈部淋巴结转移的相关性暂未有文献报道。本研究拟采用免疫组织化学染色方法检测VEGF和Ang-2 在PTC 组织的表达水平，探讨其在PTC 发生及并发颈部淋巴结转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料从广东医科大学附属医院病案室选取2017年12月1日至2019年3月31日经术后病理证实的PCT 患者86 例，其中未并发颈部淋巴结转移的PTC 患者41 例、已并发颈部淋巴结转移的PTC 患者45 例。PTC 纳入标准：（1）病理诊断提示PTC，未合并其他类型的甲状腺肿瘤；（2）未合并桥本甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、甲状腺功能亢进症等其他任何甲状腺疾病；（3）未同时合并结节性甲状腺肿和PTC；（4）无严重的心脑血管疾病。本研究通过广东医科大学附属医院科研伦理委员会批准，遵循赫尔基辛宣言。

1.2 方法记录患者的临床特征信息（年龄、性别、肿块单发或多发、术中肿块大小）。收集患者的手术石蜡组织标本，以4 μm 厚度进行连续切片，行苏木素-伊红（HE）染色，同时采用免疫组织化学染色法Max VisionTM法检测切片标本中VEGF和Ang-2 的表达水平，将磷酸盐缓冲液作为一抗进行阴性对照，分析比较上述分子标志物在PTC 组织和癌旁组织的表达和比较VEGF 和Ang-2 不同强度表达的临床特征信息差异。

1.3 观察指标免疫组织化学染色结果是采取双盲法由2 位经病理科医师指导后的研究员独立阅片得出。用磷酸盐缓冲液作为第一抗体进行阴性对照，VEGF 在免疫组织化学染色中的阳性标准主要表现为细胞胞质着色（浅黄色、棕黄色或棕褐色），见图1。将染色结果表达水平为中等阳性（++）和强阳性（+++）定义为高表达。Ang-2 主要表现为细胞胞质着色（浅黄色、棕黄色或棕褐色），见图2。参照免疫组化结果判读方法标准，每张切片标本组织随机选取5 个高倍视野（× 400），注意避开边缘组织，进行阳性细胞计数并计算阳性细胞比例，结果取5 个高倍视野阳性细胞比例的平均值并进行评分（0 ～4 分），同时判断染色强度并进行评分（0 ～3 分），最后以阳性细胞比例的评分值与染色强度的评分值的乘积来判断VEGF 和Ang-2在切片标本组织中的表达水平。

图1 VEGF 在两组中的阳性染色（×200）Fig.1 The positive plasma staining of VEGF（×200）

图2 Ang-2 在两组中阳性染色（×200）Fig.2 The positive plasma staining of Ang-2（×200）

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件分析数据。计数资料以例数和百分数表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF 在癌旁正常甲状腺组织和PCT 组织的表达VEGF 在癌旁甲状腺组织和PTC 组织呈高表达（++、+++）的比例分别为26.7%和71.3%，两组差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。不同性别、年龄、肿瘤数量以及直径大小的患者VEGF 表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表1 VEGF 在两组的表达水平Tab.1 Immunohistochemical results of VEGF in adjacent tissues and PTC

2.2 Ang-2 在癌旁正常甲状腺组织和PCT 组织的表达Ang-2 在癌旁甲状腺组织和PTC 组织呈高表达（++、+++）的比例分别为31.4%和66.3%。两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。不同性别、年龄、肿瘤数量以及直径大小的患者Ang-2表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 Ang-2 在两组的表达水平Tab.2 Immunohistochemical results of Ang-2 in para-carcinoma tissuesand PTC

表3 VEGF 和Ang-2 在PTC 中表达与临床病理参数间的关系Tab.3 Correlation between the expression of VEGF and Ang-2 in PTC and clinicopathological parameters

3 讨论

VEGF 可强烈促使血管内皮细胞进行有丝分裂，是一种调控血管形成的细胞因子，在促进血管内皮细胞增殖、迁移和诱导血管形成中发挥着重要作用，目前被认为是促进恶性肿瘤血管形成的最强细胞因子［6］。VEGF 家族是由6 个有共同受体的半胱氨酸残基组成的生长因子，包括VEGF-A、B、C、D、E 及胎盘生长因子（placental growth factor，PGF）［7］。其中，VEGF-A 在调节表皮细胞促进血管生长过程中发挥最重要的功能；VEGF-B 在非新生血管形成的肿瘤中起作用；VEGFC 和VEGF-D 是特异性淋巴管生成因子，与淋巴结转移密切相关；VEGF-E 是一种潜在的新生血管形成因子；PGF 在实验性脉络膜新生血管中的表达较高，促进新生血管形成。胆管癌组织中VEGF 蛋白高表达，并与肿瘤分化、血管侵犯、神经浸润、淋巴结转移及临床TNM 分期有关，提示VEGF 在恶性肿瘤侵袭转移中起重要作用［8］。国内外学者对甲状腺结节性病变和PTC 组织进行研究，结果显示VEGF 在两种疾病中的表达无显著性差异［9-10］。HUANG 等［11］和JANG 等［12］研究发现VEGF 在已并发颈部淋巴结转移的PTC 组织表达高于未并发颈部淋巴结转移的PTC 组织，表明VEGF 的高表达与PTC 并发颈部淋巴结转移有关。本研究中VEGF 表达水平在PTC组织中较正常甲状腺肿组织中增高，提示VEGF 对于诊断PTC 有较好的临床意义，有望成为诊断分子及治疗靶点。并发与未并发颈部淋巴结转移患者VEGF 的表达水平差异无统计学意义。分析可能的原因为本研究通过免疫组化方法检测VEGF表达，但未能明确家族中不同功能亚型的具体表达水平，各亚型在PTC 是否伴有淋巴结转移的临

床意义可待后续的研究进一步求证。

Ang 家族作为血管和淋巴管形成的调节因子而受到越来越多的关注，其中Ang-1 和Ang-2 具有较好的特征性。Ang-1 广泛表达于成人组织，具有促进血管成熟和稳定的作用，与之相反，Ang-2 的表达多发生在血管内膜去稳定化和血管重建的过程，如炎症、肿瘤等病理状态［13-14］。毛海波等［15］研究表明结肠癌患者血清中Ang-2 明显增高，且与术后早期复发转移及不良生存预后相关。KANG等［16］发现Ang-1 的高表达与肿瘤大小＞1 cm、包膜侵犯、甲状旁腺外扩张、淋巴血管浸润、淋巴结转移和复发呈正相关，是淋巴结转移和淋巴血管浸润的独立危险因素，但Ang-2 与临床病理特征无明显相关性。相反，HSUEH 等［17］通过免疫组织化学染色方法对Ang-2 的表达水平与PTC 临床分期的关系进行探讨，发现Ang-2 在已并发颈部淋巴结转移的PTC 组织表达高于未并发颈部淋巴结转移的PTC 组织。本研究结果显示Ang-2 的表达水平较正常甲状腺肿组织中增高，但其表达高低和是否合并有淋巴结转移并没有相关性，提示Ang-2 对诊断PTC 有一定的临床意义。同时本研究发现，不同性别、年龄、肿瘤数量以及肿块大小的PTC 患者VEGF、Ang-2 表达差异无统计学意义，和上述部分研究中并不相一致。本研究团队在后续研究中有条件可以进一步扩大样本量进行佐证。

综上所述，VEGF 和Ang-2 对于PTC 的预测有较好的临床意义，有望成为诊断的分子标记物及治疗靶点，可以开展更深入的分子机制研究。尚未发现VEGF 和Ang-2 对PTC 是否伴有淋巴结转移预测的诊断价值。