南方某镇自来水中微生物多样性研究

景 明，李继影

(江苏省苏州环境监测中心，江苏 苏州 215004)

0 引言

预防和控制水传播疾病是保障饮用水安全的基础工作。根据世界卫生组织（World Health Organization）和联合国儿童基金会（UNICEF）的数据，目前世界上约每8 个人中就有一个人缺乏安全的饮用水[1]。在过去的一个世纪里，用水量的增长速度是世界人口增长速度的2 倍多，随着饮用水需求量的增大，微生物污染成为饮用水安全的主要风险之一。据统计，水传播疾病在世界所有死亡率中占4%，在疾病死亡率中占5.7%。欧洲仅2007年就有8 个国家发生17例水安全事件[2]。我国2007年无锡太湖水体富营养化，导致无锡市区大范围自来水含有异味，饮用水停用长达100 h[3]；2009年，内蒙古赤峰市水传播性污染事件，导致数千名居民患病[4]。

世界卫生组织（WHO）认为饮用水安全问题主要来源于微生物，检测出微生物种类多达27 项。截止目前，世界上已有报道：饮用水中可能存在的病原微生物超过30 种[5]。我国饮用水执行GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》，该标准包含总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、菌落总数、贾第鞭毛虫和隐孢子虫等共6 项微生物指标。

通过对南方某镇自来水中的微生物污染情况进行检测研究，旨在为饮用水安全管理提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA 提取

采样时间为2020年9月3日，采样地点为我国南方某镇自来水管道。采集样品体积为1 L，于冷藏条件下运回实验室进行样品预处理。样品先通过厚度为0.45 μm 的滤膜进行过滤，再用PBS 缓冲液洗脱滤膜上的过滤物，体积最后浓缩至1.5 mL。采用CTAB 方法提取DNA 后，再通过琼脂凝胶电泳分离后鉴定DNA 质量。

1.2 高通量测序

取适量DNA 作为扩增模板进行PCR 扩增。扩增区域为18S rRNA 的V4 区域[6]，扩增引物使用带Barcode 的特异引物，分别为18S V4-F∶GCGGTAATTCCAGCTCCAA，18S V4-R∶AATCCRAGAATTTCACCTCT。PCR 的反应条件：95 ℃温度条件下，保持5 min；94 ℃温度条件下，保持60 s；57 ℃温度条件下，保持45 s；72 ℃温度条件下，保持60 s。共34 个循环，最后在72 ℃温度条件下，再延长10 min，16 ℃温度条件下，再延长5 min。用2%的琼脂糖凝胶对PCR 产物进行电泳分离，用QIAGEN 公司提供的胶回收试剂盒对目的条带回收产物。用TruSeqR DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建后再经Qubit 和Q-PCR 定量，文库合格后，用NovaSeq6000 进行上机测序。

1.3 数据分析

测序得到的原始数据存在干扰数据，为使结果更加准确、可靠，需对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据（Clean Data）[7]。根据Barcode 序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode 和引物序列后使用FLASH[8]对每个样本的reads 进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags 数据（Raw Tags）；再经过严格的过滤处理得到高质量的Tags 数据（Clean Tags）[9]。

对处理后的有效数据进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类和物种分类分析。用Uparse软件进行聚类，以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units）。用Mothur方法与SILVA138 软件进行OTUs 序列的物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对OTUs 进行丰度和Alpha 多样性计算。

2 结果与分析

2.1 测序质量分析

测序共得到91 755 条原始序列，过滤后得到64 703 条高质量有效序列。对序列进行抽样，将得到的OTU 数量作稀释曲线（Rarefaction Curve）；将OTUs 丰度排序与对应的OTUs 的相对丰度作图，得到等级聚类曲线（Rank Abundance）曲线见图1。

图1 不同样品的稀释曲线（a）与等级聚类曲线（b）

由图1 可以看出，本次测序得到的稀释曲线与等级聚类曲线趋于平缓，证明测序得到的结果能反应样品中绝大部分细菌的生物信息。

物种数量是测序得到的物种数目（即OTUs 数目）。Shannon-Wiener 指数是样品中的分类总数及其占比。群落多样性越高，物种分布越均匀，该数值就越大。Simpson 指数表征群落内物种分布的多样性和均匀度，该值越大表示OTU 对应的物种分配越均匀。

测序Alpha 多样性计算见表1。

表1 Alpha 生物多样性指数

本研究中的Shannon-Wiener 指数和Simpson 指数反映出样品中物种分布较不均匀。Chao1 指数是估计群落样品中包含的物种总数，ACE 指数是估计群落中OTU 数目。这2 个值越大表示测序得到的物种数越多。由表1 可以看出，本研究中这2 个值均较大，表明物种数较多，生物多样性较为丰富。

2.2 自来水中的细菌多样性分析

本次测序得到的1 016 个OTUs 分类结果显示：共有37 个不同门的细菌。前8 个门的相对丰度见图2。由图2 可以看出，变形菌门（Proteobacteria）的占比最大为84.4%，其次为拟杆菌门（Bacteroidota）占比为5.5%，酸杆菌门（Acidobacteriota）占比为1.9%。任红星[10]在对中国某中部城市饮用水厂中微生物多样性的研究中发现，变形菌门是饮用水中的优势种，占饮用水中微生物的50%～97%。侯鸾凤[11]在对南方某自来水厂的微生物多样性研究中发现，主要优势菌为变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，与本研究结果有所不同。

图2 自来水样品在门水平的细菌组成及占比

变形菌门（Proteobacteria）是水环境中最普遍存在的原核生物，包括光和营养型、化能自养型和化能异养型细菌3 大类[12]。为了解主要门类细菌的物种组成，对变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）的组成进一步分析，结果见图3 和图4。

图3 自来水样品变形菌门基于纲水平（a）和目水平（b,c）的组成

图4 自来水样品拟杆菌门（Bacteroidota）基于纲水平（a）和目水平（b）的组成

由图3 可以看出，本次检测出的变形菌门（Proteobacteria）包括β-变形菌纲（Gammaproteobacteria，占比为92%）和δ-变形菌纲（Alphaproteobacteria，占比为8%）2 个纲。其中β-变形菌纲（Gammaproteobacteria）主要由伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales，占比为53%）和假单胞菌目（Pseudomonadales，占比为44%）组成；δ-变形菌纲（Alphaproteobacteria）则主要由根瘤菌目（Rhizobiales，占比为51%）、柄杆菌目（Caulobac－terales，占比为28%）、鞘脂单胞菌目（Sphingomon－adales，占比为12%）和（Azospirillales，占比为3%）组成。

由图4 可以看出，本次检测的拟杆菌门（Bacteroidota）几乎全部为拟杆菌纲（Bacteroidia，占比接近100%），而拟杆菌纲（Bacteroidia）则主要由(Chitinophagales，占比为9%)、噬纤维菌目（Cytophagales，占比为7%）、（Flavobac－teriales，占比为10%）和鞘脂杆菌目（Sphingobacter－iales，占比为74%）4个目组成。

2.3 自来水中的病原菌及其潜在风险分析

自来水中微生物安全风险主要来源于病原菌，研究重点对病原菌进行分析。已被研究认定为病原菌的类别可参考相关文献[13-15]。样品中测出的6 种病原菌属共占总生物量的33.66%，详见表2。侯鸾凤[11]的研究发现，条件致病菌占饮用水总生物量的40%以上。本研究测出的病原菌在总生物量的占比略低于以往研究报道。

表2 样品中测出的病原菌（基于属水平）

值得注意的是，检测出本研究中不动杆菌属（Acinetobacter）的含量较高，占总生物量的33.26%，占变形菌门的39.39%。不动杆菌属（Acinetobacter）属于条件致病菌，虽尚没有关于人群因饮用含不动杆菌属细菌的饮用水而引起胃肠道感染的证据，但有可能通过饮用水引起易感个体的非胃肠道感染的传播[16]。

3 结论

（1）采样点自来水中共监测出37 个门72 个纲、156 个目、202 个科、280 个属的原核生物。其中主要细菌为变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroi-dota），累计占总生物量的89.9%。检测出的6 种病原菌属于常见致病菌，分别为气单胞菌属（Aeromonas）、大肠志贺氏杆菌（Escherichia-Shigella）、军团杆菌（Legionella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）和分枝杆菌（Mycobacterium）。周昭彦等[17]对上海市14 所医院自来水中潜在病原菌进行检测，发现阳性率为100%，其中分支杆菌最多，假单胞菌属次之。HUANG J 等[18]对中国东部地区自来水厂及管道中的病原微生物进行检测，通过培养法检测出大肠菌群浓度为1 700～2 300 L-1，但通过qPCR 监测出大量病原微生物，主要为军团杆菌和分枝杆菌，菌群浓度分别为5.33 和4.87 mL-1。本研究自来水中病原菌主要为不动杆菌属（Acinetobacter），占总生物量的33.26%，属于病原菌中的优势菌。

（2）近年来，由于不动杆菌属（Acinetobacter）抗生素的耐药性增加被引起广泛关注。据报道，不动杆菌属（Acinetobacter）易引起医院、社区的感染[19]。虽然不动杆菌属（Acinetobacter）是一种常见的微生物，但关于这类病原菌在食品或饮用水中的传播情况却极少报道。不动杆菌属（Acinetobacter）革兰氏阴性，不产孢子、不发酵，属于严格需氧微生物。VAN A 等[21]在比利时自来水生产及管道传输中检测出大量不动杆菌，丰度高达47.5%。这与本研究结果有一定的相似性，需对其可能引起的微生物风险给与高度重视，建议在该区域选择合适的饮用水灭菌方式对经过管道运输的饮用水进行末端再处理，以保障饮用水安全。