除草活性菌株HL-1产孢发酵条件研究

高汉峰，刘雨芹，程 亮，郭青云

(青海大学农林科学院 植物保护研究所，青海省农业有害生物综合治理重点实验室，农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海 西宁 810016)

植物内生真菌HL-1分离自青海省化隆县刺儿菜患病的叶片，并由青海省农林科学院植物保护研究所保存。研究发现，该菌株发酵液对藜(Chenopodiumalbum)和猪秧秧(Galiumaparine)等部分阔叶杂草具有较好的防除效果且对青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook.f.)、油菜(BrassicanapusL.)等主栽作物没有影响，有望制成微生物菌剂，用于防除以阔叶杂草为主要草害的农田[1]。该菌株以同心圆方式在PDA培养基上生长，分生孢子椭圆形，具有较发达的气生菌丝；经鉴定，菌株HL-1本质为植物内生真菌[1]。碳氮源、培养基含水量、培养时间、培养温度等都属于控制参数，它们可以直接影响菌体的产量和质量[2]。一般来说，生防菌的发酵方式有液体发酵和固体发酵两种方式，但是液体发酵极容易受到细菌等杂菌的污染且长时间的发酵菌种易退化；而固体发酵由于成本低廉、发酵菌运输方便且容易储藏等优点受到了人们的青睐[3]。目前关于生防菌产孢发酵的报道有很多[4-5]。张洁等[6]以粉红螺旋聚孢霉NF-06产孢量为目标，筛选出麦麸和麦秸秆以质量比4∶1混合后作为基础培养基，并在其中添加10%的玉米粉，2%蚕豆粉，0.05%KH2PO4时产孢量达到最大；后期正交优化了初始pH、含水量、接种量的比例使其产孢量最大。Kaur等[7]以生防菌AlternariamacrosporaMKP1产孢量为考察，优化结果表明该菌株在pH为6.5，温度为25 ℃，相对湿度93%条件下产孢量最大。朱海霞等[8]以多孢木霉HZ-31为研究对象，筛选出了该菌的最适碳氮源为小麦粉和硫酸铵，适合的基质为麦秆糠，并以培养基含水量、温度、培养时间为考察因素优化了其产孢的最佳组合。而卢智琴等[3]对禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)生防真菌AT9固体底物、营养物质及发酵条件进行了优化，筛选出了适合该菌株生长的基质、附加的碳氮源及比例并得出该菌株在20%接种量、32 ℃的黑暗培养、8 d的培养时间为最佳培养条件。综上所述，生防菌的固体发酵不论是代谢产物还是产孢都具有研究意义。目前对于植物内生菌的发酵条件研究主要集中在以内生菌产生的一类化学物质为目标，以其优化出最适合产该物质的条件；而对于内生菌的产孢量的研究涉及很少。本实验也以HL-1菌株的最大产孢量为最终目标，利用单因素法确定了该菌株产孢的最适碳源、氮源以及培养基质，利用正交试验确定基质的最佳组合和菌株基质培养条件的优化。对于菌株而言，明确各产孢量与各因素关系，为该菌的菌剂研制提供理论基础，也为后期该菌的各项研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

植物内生真菌HL-1分离于青海省化隆县自然感病的刺儿菜，由青海省农业有害生物综合治理重点实验室提供。

1.2 培养基

(1)基础培养基Ⅱ配方：葡萄糖40 g，酵母膏10 g，磷酸钠2 g，硫酸镁1 g，自然pH值[9]。

(2)PDA培养基：马铃薯200 g，琼脂粉20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，自然pH值。

1.3 试验设计

1.3.1 最适碳源氮源的确定

设计单因素试验，以等质量的玉米粉、小麦粉、蔗糖、葡萄糖分别作为C1、C2、C3、C4的碳源；以等质量的硝酸钾、大豆粉、酵母浸膏、(NH4)2SO4分别作为N1、N2、N3、N4的氮源，按2%的添加量，将供试碳氮源添加到PDA培养基中，充分混匀，配制成不同碳氮源类型的培养基[10]。在经活化的且菌丝生长旺盛的边缘用打孔器(8 mm)取菌饼，接入培养基(9 cm)的中央，在 26 ℃条件下黑暗倒置培养7 d并定期以血球计数法统计产孢量，同时用分光光度计在600 nm波长下测其菌悬液D值。以不加碳氮源的PDA培养基为对照，每处理3个重复。

最后再将筛选出的最适碳氮源结合制成培养基，统计其产孢量，得出最适碳氮源的最终产孢量，确定筛选效果[11-13]。

1.3.2 固态发酵基质筛选

选用低成本的羊粪、麦麸、菜籽饼、麦秆糠、珍珠岩和蛭石为培养基质[14]。将基质分别放入白塑料盘中，将一定量的无菌水加入到待选的固态发酵基质中混匀，加入水的量刚好使得基质可以在手中攒成团为宜，然后加入基础培养基Ⅱ的营养成分，充分混匀，于121 ℃灭菌 30 min，待冷却后每个处理接菌液200 mL。放入20 ℃的室内培养，培养7 d后测出其孢子悬浮液的D值。

1.3.3 最适接菌量确定

将25 g菜籽饼加入三角瓶(150 mL)中，灭菌后，在超净工作台中加入培养基Ⅱ的营养成分并混匀，再在每个三角瓶中加入无菌水20 mL。将基质体积的10%、20%、40%、60%、80%、100%菌悬液接入三角瓶内，培养7 d后用血球计数板统计确定产孢量最高的接菌量。每个处理3个重复。

1.3.4 最适培养基含水量范围

准确称取25 g菜籽饼后，装入三角瓶(150 mL)，加入基础培养基Ⅱ营养物质混匀，按基质体积分数分别加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%蒸馏水[15-16]，灭菌后接种基质体积分数30%的该菌株，放入恒温培养箱25 ℃培养，观察三角瓶内菌落的生长状况，7 d后测孢子悬浮液的D值，结合D值和菌落生长状况，得出适合该菌生长的培养基含水量范围。每个处理设3个重复。

1.3.5 最适培养基温度范围

准确称取25 g菜籽饼后，装入三角瓶(150 mL)，加入基础培养基Ⅱ营养物质混匀后灭菌30 min，在超净工作台上加无菌水40 mL，将适量菌悬液接入三角瓶内，在恒温箱中设定15、20、25、30、35 ℃黑暗培养，7 d后测孢子悬浮液的D值，结合D值和三角瓶内菌落生长状况，得出适合该菌生长的培养温度范围。每个处理设3个重复。

表1 HL-1菌株发酵条件的二次回归正交旋转组合设计

1.3.6 二次正交旋转组合设计

取培养时间和单因素实验筛选出培养温度，培养基含水量作为3个考察因素，分别各取5个水平，二次回归正交旋转组合设计以确定HL-1的最优培养条件[16-17]。在三角瓶内做正交试验，方法同上，每个处理设3个重复。

2 结果与分析

2.1 HL-1菌株碳氮源筛选

2.1.1 HL-1在PDA上的菌落形态

菌落疏松，易挑取。菌落以同心圆的方式生长，具有发达的气生菌丝，生长前期为白色，后期颜色逐渐变为褐色，最后变成黑色(图1)。

图1 HL-1菌株在PDA上的菌落形态(25 ℃，7 d)Fig.1 Colony morphology of HL-1 strain on PDA (25 ℃，7 d)

2.1.2 不同的碳氮培养基HL-1菌株的菌落形态

如表2和图2所示，在碳源培养基上HL-1菌落生长为白色或者乳白色，在氮源培养基上生长为褐色或灰褐色；在C4培养基上菌落旺盛的生长，在C1和C3培养基上生长有发达的气生菌丝；在N3培养基上，HL-1具有较大的菌落且长势最好，N4上具有较小的菌落，长势也较差。

表2 HL-1菌株在不同碳氮源培养基上菌落形态记录表

图2 不同的碳氮培养基HL-1菌株的菌落形态Fig.2 The colony morphology on different carbon and nitrogen sources of HL-1 strain

在不同碳氮源培养基上HL-1孢子数及菌悬液D值分别用血球计数法和分光光度计法测定，测定结果见表3。在4种碳源的培养基中，C4的产孢量最高，为1.50×108CFU·mL-1，孢子悬浮液的D值同样也最大，且测定悬浮液D值与其他碳源孢子悬浮液D值之间具有极显著(P<0.01)的差异；在4种氮源培养基中，N3产孢量最高，为2.20×109CFU·mL-1，悬浮液D值与其他氮源孢子悬浮液D值之间有极显著(P<0.01)差异；把C4和N3结合制成的混合培养基，产孢量为4.81×109CFU·mL-1，是最大的产孢培养基质。综上，菌落生长形态、气生菌丝发达状况、产孢量和D值，确定葡萄糖和酵母浸膏是最适HL-1产孢的碳源和氮源。

表3 不同碳氮源培养基上HL-1菌株的平均产孢量和孢子悬浮液D值

2.2 HL-1菌株固态基质筛选

观察基质表面菌丝生长状况，7 d后将其过滤后制成孢子悬浮液，然后使用紫外分光光度计测出每种悬浮液的D值，D值可以衡量该菌株在不同基质内的产孢量大小。

由朗伯-比尔定律可知孢子悬浮液孢子浓度和D值为正比关系，而孢子悬浮液的浓度反映了产孢量大小。由图3可以看出：HL-1菌株培养的基质中D值最大的为菜籽饼，最小的为蛭石。显著性方面，菜籽饼与其他5种培养基质差异显著(P<0.05)；而麦秆糠、羊粪、麦麸、珍珠岩，它们之间的差异不显著(P>0.05)，蛭石与其他5种培养基差异也显著(P<0.05)。由此可知，在供试的6种基质中，适合HL-1菌株产孢的是菜籽饼。

不同处理间没有相同大写字母或小写字母表示在0.01水平和0.05水平上差异显著。The bars without the same uppercase letters and lowercase letters indicated the significant differences at 0.01 and 0.05 level，respectively.图3 不同培养基质下HL-1菌株的孢子悬浮液平均吸光度Fig.3 Average absorbance of spore suspension of HL-1 strain in different culture substrates

2.3 HL-1菌株发酵最适接种量

HL-1菌株在接种量分别为10%、20%、40%、60%、80%、100%的条件下，平均产孢量分别为2.20×105、3.54×106、3.55×108、2.78×107、1.03×105、5.11×104CFU·mL-1。产孢量最高为3.55×108CFU·mL-1，与之对应的接种量为40%。接种量高于或低于此值都会引起产孢量急剧下降且菌落生长变差。故HL-1菌株的最适接种量为40%。

2.4 HL-1菌株培养条件正交优化试验

在含水量这个单因素对固态基质产孢量影响的试验表明：HL-1的培养基质的含水量为50%～80%，菌落生长旺盛；在培养温度这个单因素对产孢量的影响的试验表明：HL-1菌株的生长适宜的温度范围为20～35 ℃。为下一步的正交试验提供温度标准；培养时间范围：HL-1菌株培养时间为3～14 d，14 d后生长基本停止。

选用三角瓶(150 mL)中加入菜籽饼后进行正交试验，取培养基含水量，培养温度以及培养时间作为考察条件，分别取5水平来优化该菌培养条件(表4)。每个处理设3个重复。二次回归正交旋转组合进行试验设计，当二次回归模型建立后，对回归模型做方差分析。

表4 正交优化试验方案及结果

由回归方程得，3个因素中系数最大的为X1(培养基含水量)，X1对HL-1菌株的Y(产孢量)的值起主要效应；系数最小的X3(培养时间)对Y值的影响最小；三因素的频率95%分布区间均在一定范围内服从正态分布；分析时可忽略X1X2、X1X3和X2X3的互作效应。数据处理后，得出植物内生真菌HL-1优化后的产孢的条件：含水量37%培养基质，27.5 ℃黑暗培养温度，8 d的培养时间。

3 结论与讨论

不同菌株具有不同的发酵条件，优化出的合适的发酵条件可以帮助菌株在工业化生产中降低成本，减少工作量[18]。从青藏高原特殊的环境中患病的大刺儿菜中分离出的植物内生真菌HL-1菌株，前人研究表明：该菌株对阔叶杂草藜等具有很强的致病性，但对青稞、油菜等作物安全，具有制成生物除草剂的潜力。本研究选择单因素法来筛选适宜HL-1菌株生长的碳氮源、发酵基质并确定了最佳接种量。正交优化试验得出各因素组合产孢量最大的组合。获得了产孢量较大的发酵条件，为该菌工业化生产和商品化开发除草剂奠定基础。

研究结果表明：碳氮源、接菌量、培养温度可以显著提高HL-1菌株的产孢量。除草活性HL-1菌株最适产孢的碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸膏；在待选培养基质中菜籽饼最适合该菌株产孢。不同的培养基质产孢量有较大的差异，可能是因为不同的基质内含有的菌株所需求的大量元素及微量元素等不同或者它们的比例不同。有趣的是，在最适碳氮源混合培养基内HL-1产孢量达4.81×109CFU·mL-1，但在PDA培养基内产孢量仅为5.79×108CFU·mL-1；前者较后者有了显著的提升，达到了10倍的数量级，这说明PDA培养基本身并不适合HL-1生长，加入适合的碳氮源对于菌株的利用具有意义。有研究表明：合适的接种量不但能增加产孢量，而且也能减少发酵的周期甚至可以避免杂菌污染。本研究结果表明，该菌的固态发酵的最适的接种量为体积分数40%，低于或者高于这个值产孢量会降低很多，这也间接说明了接种量的研究对该菌株的重要性。另外，正交优化试验中以固态培养基含水量、培养温度、培养时间作为考察，得出在固态培养基含水量37%、培养温度27.5 ℃、发酵8 d的条件下该菌株产孢量达到了最大。史毅等[19]研究发现，培养基的不同成分碳源、氮源、微量元素等以及发酵条件温度、pH值、溶氧量等对菌株的液体及固体发酵具有很大的影响，因为HL-1菌株的发酵目的是产孢量且后期可能需要开发成可湿性粉剂，所以本文主要优化了固态发酵。本研究中获得了HL-1菌株固态发酵产孢量最大的条件，旨在为该菌的生物除草剂研究奠定基础。生防菌的固态发酵基质要求既要节约成本，又要符合国家的可持续发展的整体目标；故农业生产中的下脚料由于容易得到且价格较低成为了固态发酵基质的首选[20]。本研究中，HL-1菌株适合的固态培养基为菜籽饼，由于价格便宜等原因更适合HL-1菌株的大批量生产。下一步将筛选适合HL-1菌株孢子储藏、运输，且具有保护作用的助剂，为HL-1菌株的剂型的制备提供参考。

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