楼葱不同极性提取液对水果采后病原菌的抑菌活性

杨文博，张 强，刘 慧，吕真真，刘杰超，张光弟，焦中高，*

（1.中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009；2.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

新鲜水果采摘后易受病原菌侵染而导致腐烂，从而造成巨大的资源浪费和经济损失。我国果蔬产量位居世界第一，每年果蔬采后损耗约为25%～30%，直接经济损失高达700亿元[1]。引起水果采后致病性腐烂的主要病原菌有青霉属（Penicilliumspp.）、灰葡萄孢属(Botrysisspp.)、链格孢属(Alternariaspp.)、根霉属(Rhizopusspp.)等[2]。其中青霉属中的扩展青霉、意大利青霉是引起水果采后青霉病的主要病原菌，常见于苹果、梨等仁果类果实的采后贮藏中[3-4]。葡萄、草莓、猕猴桃等浆果类果实的采后灰霉病主要是由灰葡萄孢菌侵染引起的[5-7]。鲜枣、瓜类采后易受链格孢菌侵染而导致黑斑病[8-9]。根霉软腐病是导致桃、杏、樱桃等核果类果实采后腐烂的主要病原菌[10-12]。水果采后病原菌不仅导致果品品质下降，由其产生的次级代谢产物如链格孢酚[13]、棒曲霉素[14]等，具有致癌、致畸和免疫毒性，存在严重的食品安全隐患。

针对水果采后病害，目前国内外主要以化学防腐保鲜为主，常用的化学防腐剂有抗菌灵、仲丁胺、特克多等。但长期使用化学防腐剂存在残留期长、病原菌抗药性增强等缺点。随着人们对果品质量安全要求的提高和环境保护意识的增强，公众迫切需要寻找安全、无毒的新型防腐保鲜剂。近年来，一些药用植物提取物因含有丰富的抗氧化和抑菌成分，如黄酮、酚类、多糖、挥发油、生物碱等，能有效抑制微生物入侵和生长，而成为开发天然保鲜剂的研究热点[15-18]。王婷[19]发现丁香提取物对灰霉菌有明显的抑菌作用，并显著降低了草莓腐烂率。陶永元等[20]利用茶多酚的抑菌作用有效延长了樱桃果实的贮藏期。

现代药理研究表明，葱属植物具有抗肿瘤[21]、抗癌[22]、抑菌[23]和抗氧化[24]等功能活性，富含潜在的抑菌活性成分。楼葱（Allium cepaLinn.var.proliferumRegel）为百合科（Liliaceae）葱属（Allium）洋葱的变种，主要分布于我国东北、华北、西北等地，是我国北方传统蔬菜和重要经济作物[25]。本研究以楼葱全株为原料，对其不同极性溶剂提取液的总酚含量、类黄酮含量、抗氧化活性、抑菌活性进行测定及相关性分析，探明了楼葱最佳抑菌活性部位，为挖掘天然植物抑菌成分，创制新型保鲜剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

新鲜楼葱购于宁夏。供试菌株为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、扩展青霉（Penicillium expansum）、黑根霉（Rhisopus nigricans）、链格孢菌（Alternaria alternata），均为实验室从水果中筛选获得的优势病原菌。PDA培养基、琼脂粉，均购于北京奥博星生物技术有限公司。Folin-C试剂、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），没食子酸标准品（≥99%）、儿茶素标准品（≥99%）、抗坏血酸标准品（≥99%），均购于美国Sigma公司。硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、碳酸钠、氯化钠、乙醇、甲醇、二甲基亚砜（DMSO）均为分析纯级，购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

RE-2000型旋蒸蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；JY2002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；Alpha 2-4 LSCplus型冷冻干燥机，德国CHRIST公司；JYL-G12E榨汁搅拌机，中国九阳股份有限公司；DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；DHP-9052型生化培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；H1406632型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；WFJ 7200型紫外分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 楼葱不同极性提取液的制备

将新鲜楼葱清洗、晾干、切段后称取1 100 g，放入榨汁搅拌机中打碎，然后用80%乙醇和水作为提取溶剂对楼葱进行梯次提取，料液比为1∶4（m/V），每种提取溶剂浸泡3次，每次浸泡3 d，过滤后合并浸出液，减压浓缩后得到楼葱乙醇提取物和水提取物。楼葱乙醇提取物加蒸馏水充分溶解后，依次用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚梯次萃取，每种溶剂重复萃取3次后合并萃取液，减压浓缩后得到正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相及水相4个不同极性部位。因此，共得到楼葱5个不同极性部位提取物。

1.2.2 楼葱不同极性部位提取物中总酚、类黄酮含量及抗氧化活性的测定

将楼葱5个不同极性部位提取物分别溶于甲醇中，并稀释至适宜浓度。

总酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[26]测定，以没食子酸为标准曲线，总酚含量换算为μg GAE/mg。

类黄酮含量：采用硝酸铝比色法[27]测定，以儿茶素为标准曲线，类黄酮含量换算为μg CA/mg。

抗氧化活性：参考Geng等[28]的方法略做改动，以抗坏血酸DPPH·清除率为标准曲线，结果换算为μg VC/mg。

1.2.3 菌种悬浮液的制备

将4株供试菌株接到PDA斜面培养基中，28℃活化48 h后，在无菌条件下，加入5 mL无菌生理盐水中振荡摇匀，将菌种悬浮液稀释到1×105个/mL（血球计数板计数），置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.4 牛津杯法测定抑菌圈直径

取楼葱不同极性部位各1mg，溶于1mL 5%DMSO溶液中即为待测样品，4℃冰箱保存待测。将PDA固体培养基灭菌后，倒入一次性培养皿中，待冷却凝固后，每皿各取100μL菌种悬浮液，用一次性灭菌涂布棒均匀涂布、晾干后，用无菌镊子在固体培养基上放置直径为6 mm的牛津杯，然后每个牛津杯中加入待测样品溶液100μL，同时每个培养皿用0.5%DMSO设置一个溶剂对照组，每组待测溶液设置3组重复，放入4℃冰箱扩散12 h后，置于28℃培养箱中培养24 h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径[29]。

1.2.5 楼葱不同极性部位提取物对4种病原菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

采用二倍稀释法[30]，准确称取楼葱不同极性部位添加到PDA培养基中，摇匀，制成最终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0 mg/mL的含药培养基。将含药培养基倒入培养皿中，冷凝后加入100μL浓度为1×105的孢子悬浮液，涂布。每个浓度梯度设置3个重复试验组。然后置于28℃培养箱中培养48 h后观察，以无菌生长的培养皿的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。将无菌生长的培养皿继续培养48 h后观察，以无菌生长的培养皿的最低浓度为最小杀菌浓度（MBC）。

1.2.6 数据处理

试验设置3个重复，每项指标测定3个平行，方差及相关性用SPSS16.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按照“1.2.2”方法测定的没食子酸标准曲线为:Y=0.009 7X+0.013 8,回归系数R2=0.999 8，线性关系良好。儿茶素标准曲线为：Y=0.008 9X-0.014 5，回归系数R2=0.999 3,线性关系良好。抗坏血酸DPPH·清除率标准曲线为：Y=0.512 6X+6.777 7，回归系数R2=0.999 4，线性关系良好。其中X分别为测试溶液中没食子酸、儿茶素含量及抗坏血酸DPPH·清除率，Y为反应溶液的吸光度。

2.2 楼葱不同极性部位提取物得率、总酚、类黄酮含量及抗氧化活性的比较

表1为楼葱不同极性部位得率、总酚、类黄酮含量及抗氧化活性方差分析。对比楼葱各部位得率可知，楼葱水相和水提物得率最高，分别为3.14%和8.71%，约占楼葱总提取物的90%。正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相得率较低，且无显著差异（P＜0.05）。说明楼葱中水溶性物质较多，可能主要以水溶性多糖为主[31]。比较楼葱5个不同极性部位的总酚、类黄酮含量可知，楼葱乙酸乙酯相总酚及类黄酮含量显著高于其他部位（P＜0.05），分别为（534.23±8.93）μg GAE/mg和（172.80±2.25）μg CA/mg，其次为正丁醇相、石油醚相、水提物和水相，并有显著差异（P＜0.05）。另外，楼葱不同极性部位均有抗氧化活性，且有显著差异（P＜0.05）。其中乙酸乙酯相抗氧化活性最高，为（1 463.19±3.68）μg VC/mg，其抗氧化活性明显高于抗坏血酸。水提物和水相抗氧化活性最低，分别（79.14±0.23）μg VC/mg和（20.82±0.40）μg VC/mg。对比总酚、类黄酮含量及抗氧化活性大小发现，抗氧化活性变化趋势与总酚、类黄酮含量成正比。

表1 楼葱不同极性部位提取物得率、总酚、类黄酮含量及抗氧化活性（n=3）Table1 Theyield,total phenol,total flavonoid and antioxidant activities of variouspolar extract of Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel(n=3)

2.3 楼葱不同极性部位提取物对4种病原菌的抑菌圈直径

表2为楼葱不同极性部位对同一菌株抑菌活性方差分析，由表2可知，楼葱正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相对灰葡萄孢菌、扩展青霉、黑根霉及链格孢菌均有抑菌圈，而水相和水提物对4种病原菌均无抑菌圈。对比不同极性部位对同一菌株的抑菌圈直径可知，乙酸乙酯相的抑菌圈直径显著高于其他极性部位（P＜0.05）。正丁醇相对扩展青霉、黑根霉和链格孢菌的抑菌圈直径均显著高于石油醚相（P＜0.05），但这两个极性部位对灰葡萄孢菌的抑菌圈直径无显著差异。综上所述，楼葱水相和水提物对4种病原菌均无抑菌活性，正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相抑菌活性较好，且乙酸乙酯相抑菌活性最强，这可能与该部位总酚、类黄酮物质含量较高有关。

表2 楼葱不同极性部位提取物抑菌圈直径（n=3）Table2 Theantimicrobial circlediameter of variouspolar extractsof Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel(n=3) 单位：mm

2.4 楼葱不同极性部位提取物对4种病原菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度

由于楼葱水相和水提物对灰葡萄孢菌、扩展青霉、黑根霉和链格孢菌均无抑菌活性，因此该部分只对正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相进行MIC和MBC测定。由表3可知，乙酸乙酯相对灰葡萄孢菌、扩展青霉、黑根霉和链格孢菌均有最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，且对黑根霉有最低值，分别为1.56、6.25 mg/mL，对链格孢菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为3.12、12.05 mg/mL，对灰葡萄孢霉和扩展青霉的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为25.00mg/mL和50.00 mg/mL。说明楼葱乙酸乙酯相对4种病原菌的抑菌效果不同，黑根霉对该极性部位更敏感。

表3 楼葱不同极性部位提取物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)Table 3 Minimal inhibitory concentrations(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of variouspolar extractsof Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel(n=3) 单位：mg/mL

正丁醇相对4种病原菌的抑菌活性均弱于乙酸乙酯相，同样对黑根霉的抑菌活性最强，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为3.13、25.00 mg/mL，其次为链格孢菌，分别为12.50、25.00 mg/mL。而对灰葡萄孢霉和扩展青霉只有最小抑菌浓度，均为25.00 mg/mL。

另外，由表3可知，当含药培养基中石油醚相添加浓度为25.00 mg/mL时，才能抑制黑根霉的生长，该部位对链格孢菌、灰葡萄孢菌和扩展青霉的抑制作用更弱，最小抑菌浓度分别为50.00、100.00和100.00 mg/mL。该极性部位对4种病原菌均无最小杀死浓度。

综上所述，楼葱正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相均能有效抑制灰葡萄孢菌、扩展青霉、黑根霉和链格孢菌的生长，其中乙酸乙酯相抑菌活性最强。黑根霉对这3个不同极性部位最敏感，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度值最低，这与不同极性部位抑菌圈直径测定结果一致。

2.5 楼葱不同极性部位提取物理化指标与生物活性相关性分析

利用SPSS软件对楼葱不同极性部位的总酚、类黄酮含量、抗氧化活性及抑菌活性进行相关性分析。如表4所示，楼葱不同极性部位的总酚含量、类黄酮含量与其抗氧化活性之间呈极显著正相关（P＜0.01），说明楼葱中不同部位的多酚和类黄酮物质含量是影响其抗氧化活性的主要因素。另外，楼葱中总酚含量、类黄酮含量与4种病原菌的抑菌圈直径均呈现显著正相关（P＜0.05），说明不同部位的总酚和类黄酮含量对其抑菌活性有显著影响。

表4 楼葱不同极性部位提取物总酚、类黄酮含量与其抗氧化活性、抑菌活性的相关性分析Table4 Correlation analysisbetween total phenol,flavonoid contents and antioxidant and antimicrobial activities of variouspolar extractsof Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel

3 讨论与结论

本研究以新鲜楼葱为原料，对其不同极性部位进行分离制备，并对其得率、总酚含量、类黄酮含量、抗氧化活性进行测定。同时，选取4种常见水果采后病原菌为供试菌株，对楼葱不同极性部位的抑菌活性进行探讨，并对结果进行相关性分析。结果表明，楼葱不同极性部位提取物的总酚、类黄酮含量是影响其抗氧化活性的主要因素，说明楼葱中酚类、类黄酮类物质是主要的抗氧化活性物质，水溶性部位主要以多糖为主，抗氧化活性较低，这与李璐等[32]研究结果一致。除水溶性部位对各试验菌株无抑菌活性，其余部位均有不同的抑菌活性，这与杨粟艳[33]研究结果相同，结合表1试验结果发现抑菌活性与总酚、类黄酮含量呈正相关性，表4结果也进一步证实了上述结论。张金桐等[34]研究结果显示类黄酮物质中的羟基基团具备一定的抗菌活性。魏国华等[35]研究表明，植物多酚能通过酚羟基与酶蛋白形成多点结合，从而改变微生物酶的活性并破坏其蛋白质合成系统，抑制微生物繁殖。说明酚类、类黄酮的抑菌活性与其羟基官能团有直接关系，羟基数量越多，抑菌活性越强，这与本试验结果研究一致。另外，Xue等[36]的研究结果显示羟基可以通过清除自由基，降低水果细胞膜损伤，阻止微生物与生物体之间的物质交换，从而抑制微生物生长，说明楼葱活性成分的抑菌活性与其抗氧化活性有一定相关性，其抑菌机制可能与膜物质交换和抑制细胞蛋白质合成有关，但是还需要进一步试验验证。

综上所述，楼葱中的多酚和类黄酮物质是潜在的天然植物抑菌剂，且乙酸乙酯部位是挖掘楼葱功能活性物质的主要极性部位，可作为目标活性部位进行后续分离单体化合物，并探究其抑菌机制，为挖掘天然植物抑菌成分、开发新型植物抑菌剂提供理论依据。