降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好性分析

原晓龙 李云琴 张劲峰 王毅

摘 要： 为了解降香黄檀叶绿体基因组密码子使用模式，该文利用Codon W 1.4.2和在线软件CUSP对降香黄檀叶绿体基因组中的52条基因编码序列密码子进行中性绘图、ENC-plot和PR2-plot分析。结果表明：降香黄檀叶绿体基因组密码子的3个位置上GC含量依次为GC1（46.01%）>GC2（38.98%）>GC3（27.80%）。有效密码子数（ENC）范围为37.66～54.43，及ENC值>45的有37个;RSCU>1的密码子有29个，其中16个以U结尾、12个以A结尾。这些说明其偏好以A和U结尾，且偏性较弱。中性绘图分析显示GC12与GC3的相关系数为0.250，相关性不显著，回归系数为0.394;ENC-plot分析显示ENC比值位于-0.05～0.05区间外的基因有38个;PR2-plot分析说明在碱基的使用频率方面，U>A、G>C，说明降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好性主要受选择的影响;19个密码子被确定为最优密码子。该研究为降香黄檀叶绿体基因工程、遗传多样性分析等研究提供了科学参考依据。

关键词： 降香黄檀， 叶绿体基因组， 密码子偏好性， 选择

中图分类号： Q755

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0622-09

Abstract： To comprehend the codon usage pattern of chloroplast genome in Dalbergia odorifera， the 52 coding DNA sequences were analyzed to obtain to the results of neutrality plot， ENC-plot and PR2-plot analysis using Codon W 1.4.2 and online software CUSP in the present study. The results were as follows： The GC content in the three positions of codons from the chloroplast genome of D. odorifera was GC1 （46.01%）>GC2 （38.98%）>GC3 （27.80%） successively. The range of effective number codon was from 37.66 to 54.43， and there were 37 genes when ENC value was greater than 45， and there were 29 genes when RSCU value was greater than 1， including 16 genes ending with U and 12 genes ending with A. These suggest that the codons prefer ends with A and U， and have a weak bias. The neutrality plot showed that there was no significant correlation between GC3 and GC12， the correlation coefficient was 0.250， and the regression coefficient was 0.394; ENC-plot analysis revealed that there were 38 genes which ENC ratio located beyond the section from -0.05 to 0.05; PR2-plot analysis showed that U>A and G>C in the base usage frequency. These all illustrated that the codon usage bias in the chloroplast genome of D. odorifera was mainly affected by mutation; 19 codons were identified as the optimal codon. The present study could be useful in the chloroplast genetic engineering and genetic diversity analysis of D. odorifera.

Key words： Dalbergia odorifera， chloroplast genome， codon usage bias， selection

在生物體传递遗传信息的过程中，作为联结核酸和蛋白质的密码子扮演着重要的角色（Zhang et al.， 2019），构成基因组的4种核苷酸可形成64种密码子，各密码子与氨基酸相对应，除甲硫氨酸和色氨酸外，其余18种氨基酸均有2～6个密码子，这些编码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子（synonymous codon）（Duret， 2002）。在翻译过程中，每个氨基酸相对应同义密码子的使用频率存在差异，即有的同义密码子使用频率高于其他同义密码子，这种现象被称为密码子偏好性（codon usage bias）（Romero et al.， 2000）。密码子偏好性广泛存在于不同生物中，是物种在长期进化过程中受环境选择、碱基突变、基因漂变等因素共同作用，还受到基因组大小、tRNA丰度和基因表达水平等的影响（Romero et al.， 2000; Duret， 2000; Xu et al.， 2011）。密码子偏好性通过对基因翻译准确性和效率的调节影响基因的表达水平（邢朝斌等， 2013），叶绿体具有基因组小、基因拷贝数多等特点（Wright， 1990; 牛元等， 2018）;根据最优密码子设计叶绿体基因表达载体，可迅速提高叶绿体基因组中基因表达量，利用目前已知的密码子使用模式推断未知基因的表达，或预测某些未知基因的功能（Wu et al， 2007）;同时亲缘关系较近的物种具相近的密码子使用模式（杨国锋等， 2015）。因此研究叶绿体基因组密码子的使用模式对探讨物种进化、提高外源基因表达量等具有重要意义。

降香黄檀（Dalbergia odorifera）是蝶形花科（Papilionaceae）黄檀属（Dalbergia）常绿半落叶乔木，其心材具极高的经济和药用价值（梁远楠等， 2019; 王玥琳等， 2019; 张丽佳等， 2019），本研究已完成对降香黄檀叶绿体基因组的高通量测序，通过分析降香黄檀叶绿体基因组蛋白编码区（coding DNA sequence， CDS）序列的碱基组成、中性绘图、ENC-plot及PR2-plot等方法推断影响降香黄檀叶绿体密码子偏好性的主要因素，确定降香黄檀叶绿体基因组的最优密码子。本研究通过对降香黄檀叶绿体基因组密码子使用模式和影响密码子使用偏性的因素进行分析，确定降香黄檀叶绿体基因组的密码子偏好性及最优密码子，以期为降香黄檀叶绿体基因组的应用和研究提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

降香黄檀叶片采自云南省林业科学院热带林业研究所。将采集的新鲜叶片样品保存在干冰环境中送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行叶绿体基因组的测序，并将结果提交至NCBI（登录号：KC427274），通过GenBank Feature Extractor（http：//www.bioinformatics.org/sms2/genbank_feat.html）、ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、DNA man等软件分析降香黄檀叶绿体基因组，根据各基因的注释结果获得83条CDS序列，剔除序列长度小于300 bp、重复基因和CDS内部存在终止密码子的序列后得到52条符合条件的CDS用于分析。

1.2 方法

1.2.1 密码子组成分析 将52条符合条件的CDS 整合到一个.fasta文件中，应用Codon W 1.4.2软件分析获得各CDS的ENC（effective number of codon， 有效密码子数）、同义密码子相对使用度（RSCU），应用在线软件CUSP （http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）分析获得密码子第1位、第2位、第3位碱基的GC含量（分别为GC1、GC2、GC3）及3位碱基的GC平均含量（GCall）等参数，应用SPSS和Excel等数理的统计分析软件对结果进行分析。

ENC是衡量同义密码子使用偏度的重要指标，ENC的取值范围为20～61，ENC值的大小能够反映密码子偏性的强弱。当ENC值为20时，代表同义密码子完全处于偏倚状态;当ENC值为61时，代表同义密码子完全没有偏倚;ENC值从小到大表示偏倚性由强变弱，通常可以ENC值45作为区分偏倚性强弱的标准（秦政等， 2018）。RSCU是指某一密码子实际使用频率与无使用偏性时理论频率的比值。无偏性时，RSCU为1;RSCU小于1则代表该密码子的实际使用频率低于其他同义密码子的使用频率，反之实际频率高于其他同义密码子的使用频率（晁岳恩等， 2012）。

应用SPSS软件分析密码子不同位置GC碱基组成GC1、GC2、GC3、GCall，密码子数（N）与ENC等的相关关系，进而判断各因子对密码子偏好性的影响。

1.2.2 中性绘图分析 简并密码子第3位碱基通常所发生的为同义突变，而在密码子第1位、第2位上发生的碱基突变通常会改变基因的功能或活性，即在不存在外界压力时，密码子3个位置的碱基含量组成应该无差异;而在存在一定选择压力情况下时，密码子3个位置上的碱基组成是存在差异的（Sueoka， 2001）。在以GC1和GC2的平均值GC12和GC3分为纵、横坐标的中性绘图中，每一个散点代表一个基因。 如果中性图中的所有基因均沿对角线分布，即GC12和GC3的变异基本一致，密码子3个位置上的碱基组成无明显差異，受选择压力较弱，而受突变影响较大;回归系数（对角线斜率）是衡量中性程度的指标之一，若回归曲线斜率极小，GC12和GC3的变异的相关性同样很低，说明影响密码子偏好性的主要影响因素为选择效应（Sueoka， 2001）。同时通过分析密码子不同位置碱基组成的相关性可分析密码子偏好性受突变或选择的影响，即当GC12与GC3呈显著相关时，说明密码子3个位置的碱基组成无明显差异，偏好性主要受突变影响; 当GC12与GC3呈不显著相关时，回归系数趋近于0，说明密码子的前两位碱基与第3位碱基组成不同，基因组中的GC含量较为保守，密码子的使用偏性主要受选择影响（杨国锋等， 2015）。

1.2.3 ENC-plot分析 ENC-plot分析可探讨ENC和GC3S分布的关系，是一种通过对基因数据的密码子偏好性情况的图像可视化的有效方式，其中的标准曲线代表无选择压力存在时，密码子偏好性完全由突变决定，即完全由核酸序列组成决定密码子偏好性（Wright， 1990）。

ENC-plot绘图分析含散点图和标准曲线，散点图则以ENC为纵坐标，GC3为横坐标，标准曲线公式为ENC=2+GC3+29/[GC32+（1-GC3）2]。具体判断标准为图中散点与标准曲线的距离，散点与标准曲线的距离近则说明密码子偏好性主要由碱基组成决定，受翻译选择的影响较为微弱;距离远则说明密码子的ENC值偏低，与基因表达水平存在较强的显著性相关关系，密码子偏好性较强（尚明照等， 2011; 王鹏良等， 2018）。然而，ENC-plot绘图分析不足以准确区分中性突变和选择压力的影响程度，若当选择出现在密码子第3位碱基上时，需要结合ENC比值频数对差异进行量化分析 （Sueoka， 2001）。

1.2.4 PR2-plot分析 分析各密码子第3位上的A、T、C、G含量，以A3/（A3+T3）为纵坐标，以G3/（G3+C3）为横坐标进行PR2偏倚分析（PR2-bias plot analysis）作图，用平面图显示各基因的碱基组成，其中心点代表无偏性使用时的密码子状态，即A=T且C=G，其余点与中心点的矢量距离则代表其偏倚程度和方向（杨国锋等， 2015）。

1.2.5 最优密码子的确定 以降香黄檀叶绿体各基因的ENC作为偏好性参考标准，从两端各选择10%的基因构建高低偏性库，将两库间ΔRSCU≥ 0.08的密码子定为高表达优越密码子;将RSCU值大于1的密码子确定为高频密码子（尚明照等， 2011）。将同时满足高频率密码子和高表达优越密码子确定为最优密码子。

2 结果与分析

2.1 密码子碱基组成

用在线软件CUSP分析降香黄檀52条CDS的碱基组成，用Codon W 1.4.2分析其ENC值（表1），所有CDS密码子的平均GC含量为37.60%，第1位GC含量为46.01%，第2位为38.98%，第3位为27.80%，GC含量在密码子的不同位置分布频率不同，由高到低依次为第1位>第2位>第3位，说明在降香黄檀中，叶绿体基因组密码子末位碱基以A/U（T）为主，与植物叶绿体基因中A/U（T）含量较高的特征相符。表示偏倚强弱的ENC值的范围为37.66～54.43，平均值为46.76;52个CDS的密码子ENC值>45的有36个，说明其降香黄檀大部分基因编码序列的密码子偏性较弱。

密码子不同位置碱基的GC含量、密码子数（N）与ENC值间的相关性分析（表2）显示，GCall和GC1、GC2、GC3的相关性均达到极显著水平，GC1和GC2达极显著相关， GC3与GC1、GC2均未达到显著相关，说明密码子的第1位和第2位碱基组成相似，与第3位碱基组成存在差异。ENC与GC1呈显著相关，与GC2相关性不显著，与GC3呈极显著相关，说明ENC与密码子第3位碱基组成密切相关。ENC与密码子数（N）呈显著相关，说明基因编码序列长度对密码子使用偏性具一定影响。

各编码氨基酸的RSCU（表3）显示，RSCU>1的密码子以A和U结尾的频率较高，其中16个以U结尾、12个以A结尾、1个以G结尾，说明降香黄檀叶绿体基因组偏爱以A和U结尾，而以C和G结尾的密码子为非偏爱密码子。

2.2 中性绘图分析

降香黄檀叶绿体基因组各基因的中性绘图分析（图1），GC12的取值范围稍大，在0.309～0.536之间，GC3的取值范围很小，在0.210～0.365之间，且各基因均落在对角线上方;GC12与GC3的相关系数为0.249 6，相关性不显著，且回归系数（即趋势线的斜率）为0.393 8，即在降香黄檀叶绿体基因组中性绘图分析中，GC12和GC3两个变量间的相关性很弱，说明密码子第1位、第2位和第3位碱基组成存在差异，即降香黄檀叶绿体基因组中GC含量高度保守，且密码子第3位的GC含量较低，其密码子偏好性更多地受选择的影响。

2.3 ENC-plot绘图分析

ENC-plot绘图分析是以ENC比值[（预期ENC值-实际ENC值）/预期ENC值]和ENC比值频数来判断影响基因的主要因素，与标准曲线的距离近的基因数量较多，则其偏好性主要受突变的影响;反之以选择为主要影响因素。分析结果（图2）显示ENC比值频数表（表4）中分布在-0.05～0.05区间的基因有14个，即有14个基因与预期ENC值较接近，而分布在-0.05～0.05区间之外的基因有38个，这38个基因与预期ENC值较远，与标准曲线的距离较远。本研究中的降香黄檀叶绿体基因组中的大多数基因与标准曲线距离较远，说明降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好性更多地受选择的影响，而受突变的影响较弱。

2.4 PR2-plot绘图分析

通过PR2-plot绘图进一步分析降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好性的影响（图3），PR2平面图中4个区域的散点分布不均匀，大部分基因位于平面图的下半部，尤其是右下方的基因数量最多，说明在碱基的使用频率方面，U>A、G>C。如果密码子偏好性完全受到突变的影响，则4个碱基的使用频率相当，因此，降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好性同时受到突变和选择的影响。

2.5 最优密码子确定

将降香黄檀叶绿体基因组中的52条蛋白编码基因作为一个整体在Codon W 1.4.2软件上运行，通过构建高表达基因和低表达基因库，分别计算这两个基因库中的RSCU值，结果显示（表5），ΔRSCU≥0.08的密码子，分别为UUU（TTT）、UUA（TTA）等23个密码子，且均为高表达的优越密码子（表5中用*表示），其中：11个以A结尾，8个以U结尾，3个以C结尾，1个为G结尾。ΔRSCU≥0.3（表5中用**表示）的密码子有11个;ΔRSCU≥0.5（表5中用***表示）的密码子分别为UUU、UUA。以同时满足高频率密码子和高表达优越密码子作为最优密码子， 分别为UUU、 UUA、 AUA、GUA、UCA、AGU、CCA、UAU、GCA、CAU、CAA、AAU、AAA、GAA、UGU、CGA、AGA、GGU和GGA等19个，其中12个以A结尾，7个以U结尾。

3 讨论与结论

在生物体中，密码子在核酸和蛋白质的翻译方面扮演着重要作用;植物中不同密码子的使用频率存在差异，这种密码子使用偏好性是物种和基因长期进化和对环境的适应过程中形成的，是由于多种因子共同作用的结果，其中突变和自然选择是该现象形成的重要影响因素（Romero et al.， 2000; Xu et al.， 2011）。叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，亦含有相对独立的母系遗传基因组信息，故叶绿体基因组在揭示物种进化、不同物种间亲缘关系、物种鉴定等方面具重要价值;同时叶绿体基因工程因其可高效表达、安全等特点已成为植物基因工程的研究热点（Wright， 1990; Duret， 2000）。因此，植物叶绿体基因组密码子使用偏性的研究能够揭示物种基因组进化关系及主要影响因素。

中性进化理论认为碱基突变和自然选择对密码子第3位碱基变化的影响是中性或近中性的（Sharp et al.， 1993），即通常密码子的第1位、第2位碱基的改变会造成编码氨基酸的改变，而第3位碱基改变则对氨基酸编码无影响，可以认为密码子使用偏性在某种程度上是对偏好密码子使用与非偏好密码子保留间的一种平衡，是进化过程中的一种自我保护机制;同时因密码子第3位碱基具有的兼并性及较小的选择压力、GC3含量与密码子使用偏性的显著相关性等因素，通常将GC3作为密码子使用模式分析的重要依据（Gu et al.， 2004; Ingvarsson， 2007）。本研究中降香黄檀叶绿体基因组密码子的GC3含量远低于前两位，与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）（杨国锋等， 2015）、紫花苜蓿（M. sativa）（陶晓丽， 2017）的密码子3个位置的GC含量进行比较，即紫花苜蓿GC1（45.24%）>GC2（37.30%）>GC3（28.97%），蒺藜苜蓿GC1（45.5%）>GC2（36.8%）>GC3（26.9%），3个物种叶绿体基因组在密码子3个位置上的GC含量趋势一致，但具体数据存在一定的差异。中性绘图分析显示，密码子第1位和第2位与第3位碱基组成存在显著差异，通过其GC含量高度保守，其密码子偏好性主要受选择影响，与蒺藜苜蓿一致（杨国锋等， 2015）;同时结合ENC-plot和PR2-plot等分析方式发现降香黄檀叶绿体基因组密码子的偏好性受多种因素综合影响，主要影响因素为选择，这个结论与其同科植物蒺藜苜蓿（杨国锋等， 2015）一致。降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好以AT结尾，且其最优密码子为UUU、UUA，与大多数高等植物的最优密码子NNA、NNU的模式一致（尚明照等， 2011）。这种密码子使用模式可能由于叶绿体基因组中含有丰富的A、T碱基，且其密码子使用模式存在显著差异，而在进化和亲缘关系较近的植物通常具相似的密码子使用模式，叶绿体基因组密码子的偏好性在进化关系上较为保守。本研究中降香黄檀叶绿体基因组密码子偏好性主要受突变的影响，同时与其他因素一起共同作用于其密码子使用模式，确定了19个最优密码子，且均为NNA和NNU模式。降香黄檀的分布区较为零散，仅分布于海南全岛，及广东、广西和福建的少数地区 （张丽佳等， 2019）， 但降香黄檀叶绿体基因组密码子的偏好性与其他蝶形花科植物基本一致，未表现出特异性，说明蝶形花科植物至少在密码子偏好性方面亦较为保守。本研究为以后降香黄檀通过外源基因密码子改造的异源表达、叶绿体基因工程和遗传多样性分析提供了科學的参考依据。

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（责任编辑 周翠鸣）